特許ウォッチ

公開番号2025014047
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-28
出願番号2024191754,2022147355
出願日2024-10-31,2020-04-02
発明の名称標的核酸の検出方法
出願人TOPPANホールディングス株式会社,国立大学法人九州大学
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 9/16 20060101AFI20250121BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】シグナル/ノイズ(S/N)比が向上した標的核酸の検出方法を提供すること。
【解決手段】標的核酸と第一核酸と第二核酸とにより形成される第一開裂構造の第一フラップを切断すること、第三核酸と切断された第一フラップと第四核酸とにより形成される第二開裂構造の第二フラップを切断すること、切断された第二フラップを検出することで標的核酸の存在を検出することを含み、第一フラップを切断すること、及び第二フラップを切断することが、フラップエンドヌクレアーゼで第一フラップ及び第二フラップを切断することにより行われ、フラップエンドヌクレアーゼは、サーモコッカス目に属する菌及びメタノバクテリア目に属する菌からなる群より選択される菌のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が65%以上であるアミノ酸配列を有する、標的核酸の検出方法。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１株のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する、単離されたフラップエンドヌクレアーゼ。
続きを表示（約 340 文字）【請求項２】
パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ）ＧＥ５株のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上であるアミノ酸配列を有する、単離されたフラップエンドヌクレアーゼ。
【請求項３】
メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒＴｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＤｅｌｔａＨ株のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する、単離されたフラップエンドヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記配列同一性が１００％である、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたフラップエンドヌクレアーゼ。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の検出方法に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
標的核酸の検出による各種診断方法が知られている。そのような診断方法として、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）解析による体質診断、体細胞変異解析による薬剤（例えば、抗癌剤）の効果及び副作用の予測診断、ウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡの検出による感染症の診断等がある。これらの診断用途では、標的核酸の存在比が低い場合が多いため、標的核酸を高精度で定量解析できる方法が必要である。標的核酸を高精度で定量解析する手法として、例えば、デジタル計測を利用した方法が知られている。
【０００３】
デジタル計測は、標的核酸等の生体分子を確率的に１分子以下になるように希釈し、多数の微小な反応容器に分配し、各反応容器を２値化（検出反応に伴う信号がある／ない）することで、反応容器に検出対象が入っているかいないかをカウントする定量方法である。デジタル計測では、１分子の生体分子を検出することも可能であり、高精度な定量測定を行うことができる。例えば、非特許文献１には、ＩＣＡ（ＩｎｖａｓｉｖｅＣｌｅａｖａｇｅＡｓｓａｙ）法をデジタル計測と組み合わせた標的核酸の検出方法が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
日本印刷学会誌，２０１７年，第５４巻第６号，ｐｐ．３７７－３８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
デジタル計測は、各反応容器を２値化（検出反応に伴う信号がある／ない）することに基づいているため、より高精度な定量測定を行うためには、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）の向上が求められる。そこで、本発明は、Ｓ／Ｎ比が向上した標的核酸の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、標的核酸と第一核酸と第二核酸とにより形成される第一開裂構造の第一フラップを切断すること、第三核酸と切断された第一フラップと第四核酸とにより形成される第二開裂構造の第二フラップを切断すること、切断された第二フラップを検出することで標的核酸の存在を検出することを含み、上記第一フラップを切断すること、及び上記第二フラップを切断することが、フラップエンドヌクレアーゼで上記第一フラップ及び上記第二フラップを切断することにより行われ、上記フラップエンドヌクレアーゼは、サーモコッカス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）に属する菌及びメタノバクテリア目（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）に属する菌からなる群より選択される菌のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が６５％以上であるアミノ酸配列を有する、標的核酸の検出方法に関する。
【０００７】
本発明に係る検出方法は、第一フラップの切断、及び第二フラップの切断が、特定のフラップエンドヌクレアーゼにより行われるため、従来法よりもＳ／Ｎ比が向上している。
【０００８】
上記フラップエンドヌクレアーゼは、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ１株、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓａｂｙｓｓｉ）ＧＥ５株、及びメタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（ＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒＴｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＤｅｌｔａＨ株からなる群より選択される菌のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列との配列同一性が６５％以上であるアミノ酸配列を有するものであるのが好ましい。これにより、Ｓ／Ｎ比がより一層向上する。
【０００９】
上記検出方法において、標的核酸はＤＮＡであってよい。
【００１０】
上記検出方法において、上記第一フラップを切断すること、及び上記第二フラップを切断することが、ｐＨ７．５以上９．０以下の条件下で行われることが好ましい。ｐＨがこの範囲内にあると、Ｓ／Ｎ比の向上効果がより顕著になる。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許