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公開番号2025013853
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-28
出願番号2024181460,2020551264
出願日2024-10-17,2019-03-28
発明の名称操作された免疫エフェクター細胞およびその使用
出願人フェイトセラピューティクス,インコーポレイテッド
代理人弁理士法人谷川国際特許事務所
主分類C12N 15/85 20060101AFI20250121BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ゲノム操作されたiPSCの指示された分化から得られる、機能的に増強された誘導エフェクター細胞を取得するための方法及び組成物を提供する。
【解決手段】細胞を操作してゲノム編集された細胞を得るためのコンストラクトであって、(i)前記細胞ゲノムのCD38遺伝子座の選択された位置でCD38を標的化する左ホモロジーアームと右ホモロジーアーム、これは、(ii)1つ以上の外因性タンパク質をコードする1つ以上の核酸配列に作動可能に連結している、を含み、前記ゲノム編集された細胞が、iPSC、クローンiPSC、又は、iPS細胞株細胞であり、前記ゲノム編集された細胞が、CD38遺伝子座の前記選択された位置で1つ以上の外因性タンパク質をコードする前記1つ以上の核酸配列の標的化組み込み、及びCD38ノックアウトを含み、前記ゲノム編集された細胞が、iPSC誘導造血細胞に分化できるiPSCである、コンストラクト。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
細胞を操作してゲノム編集された細胞を得るためのコンストラクトであって、（ｉ）前記細胞ゲノムのＣＤ３８遺伝子座の選択された位置でＣＤ３８を標的化する左ホモロジーアームと右ホモロジーアーム（ＬＨＡ／ＣＤ３８、ＲＨＡ／ＣＤ３８）、これは、（ｉｉ）１つ以上の外因性タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列に作動可能に連結している、を含み、
前記ゲノム編集された細胞が、誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ、またはｉＰＳ細胞株細胞であり、
前記ゲノム編集された細胞が、ＣＤ３８遺伝子座の前記選択された位置で１つ以上の外因性タンパク質をコードする前記１つ以上の核酸配列の標的化組み込み、およびＣＤ３８ノックアウトを含み、
前記ゲノム編集された細胞が、ｉＰＳＣ誘導造血細胞に分化することができるｉＰＳＣである、コンストラクト。
続きを表示（約 4,300 文字）【請求項２】
１つ以上の外因性タンパク質をコードする前記１つ以上の核酸配列が、組込み時にＣＤ３８の内因性プロモーターに作動可能に連結され、それによって駆動されるか、または、ＣＤ３８遺伝子座の前記選択された位置がＣＤ３８のエクソンにある、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記１つ以上の外因性タンパク質が、以下のうちの少なくとも一方または両方を含む：（ｉ）高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）またはそのバリアント、（ｉｉ）細胞表面で発現した外因性ＩＬ１５／ＩＬ１５受容体融合タンパク質（ＩＬ１５ＲＦ）またはそのバリアント、ここで前記ゲノム編集された細胞およびそれからの前記誘導造血細胞は、ｈｎＣＤ１６およびＩＬ１５ＲＦ、またはそれらのバリアントをコードする前記１つ以上の核酸配列を含む、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項４】
（ｉ）前記ｈｎＣＤ１６またはそのバリアントが、
（ａ）ＣＤ１６の外部ドメインドメインのＦ１７６ＶおよびＳ１９７Ｐ、
（ｂ）ＣＤ６４に由来する完全または部分的な外部ドメイン、
（ｃ）非天然（または非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
（ｄ）非天然（または非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
（ｅ）非天然（または非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
（ｆ）非天然の刺激ドメイン、ならびに
（ｇ）ＣＤ１６に由来せず、同一のまたは異なるポリペプチドに由来する膜貫通、シグナル伝達、および刺激ドメイン、
のうちの少なくとも１つを含むか、
または
（ｉｉ）前記ＩＬ１５ＲＦまたはそのバリアントが、
（ａ）自己切断ペプチドを使用することにより共発現したＩＬ１５およびＩＬ１５Ｒα、
（ｂ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの融合タンパク質、
（ｃ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが切断されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
（ｄ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質、
（ｅ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβの融合タンパク質、
（ｆ）ＩＬ１５と共通受容体γＣの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣは天然または改変されている、融合タンパク質、
（ｇ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、ならびに
（ｈ）配列番号１７、１９、または２１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含むＩＬ１５ＲＦをコードするポリヌクレオチド、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項３に記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記ｈｎＣＤ１６またはそのバリアントが、
（ｉ）ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドに由来する非天然の膜貫通ドメイン、
（ｉｉ）ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然の刺激ドメイン、
（ｉｉｉ）ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、もしくはＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然のシグナル伝達ドメイン、または
（ｉｖ）非天然の膜貫通ドメインがＮＫＧ２Ｄに由来し、前記非天然の刺激ドメインが２Ｂ４に由来し、前記非天然のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζに由来する、
のうちの１つ以上を含む、請求項４に記載のコンストラクト。
【請求項６】
前記ゲノム編集された細胞およびそれからの前記誘導造血細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含み、前記ＣＡＲが以下の特徴
（ｉ）Ｔ細胞特異的もしくはＮＫ細胞特異的、
（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、
（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、
（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、
（ｖ）スプリットＣＡＲ、
（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、
（ｖｉｉ）誘導可能なＣＡＲ、
（ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、
（ｉｘ）細胞表面発現の外因性サイトカインまたはその受容体の部分的または完全なペプチドと共発現されたもの、
（ｘｉ）チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、
（ｘｉｉ）前記コンストラクトにさらに含まれる核酸によってコードされ、前記ＣＡＲがＣＤ３８遺伝子座の前記選択された位置に挿入されるもの、
（ｘｉｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入されている、および／またはＴＣＲの内因性プロモーターによって駆動されている、および／またはＴＣＲが前記ＣＡＲ挿入によってノックアウトされているもの、
（ｘｉｉｉ）ＣＤ１９またはＢＣＭＡに特異的なもの、および／または
（ｘｉｖ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、ＣＣＲＩ、ＣＣＲ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－ａ、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、癌－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、および病原体抗原のうちのいずれか１つに特異的なもの、
のうちの少なくとも１つを有する、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項７】
（ｉ）１つ以上の外因性タンパク質をコードする前記１つ以上の核酸配列の発現を駆動する外因性プロモーター、ここで前記外因性プロモーターは、構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、および／または細胞型特異的である、
（ｉｉ）外因性タンパク質をコードする２つの核酸配列の間に挿入されたリンカー配列、
（ｉｉｉ）ＬＨＡ／ＣＤ３８の３’末端のインスレーターとＲＨＡ／ＣＤ３８の５’末端のインスレーター、ならびに
（ｉｖ）ｐｏｌｙＡシグナル、
の１つ以上をさらに含む、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項８】
（ｉ）前記外因性プロモーターが、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、またはＵＢＣであり、
（ｉｉ）前記リンカー配列が、自己切断２Ａペプチドをコードする２Ａ配列であり、および／または
（ｉｉｉ）前記リンカー配列が、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
である、請求項７に記載のコンストラクト。
【請求項９】
ｉＰＳＣである前記ゲノム編集された細胞または前記ｉＰＳＣ誘導造血細胞が、以下の表現型
（ｉ）末梢血、臍帯血、または任意の他のドナー組織から取得されたその天然の対応細胞と比較して、より長いテロメアを含むこと、
（ｉｉ）ＣＤ３８
－／－
ＣＤ１６、
（ｉｉｉｉ）ＣＤ３８
－／－
ＩＬ１５、および／または
（ｉｖ）ＣＤ３８
－／－
ＣＤ１６ＩＬ１５
のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
ｉＰＳＣである前記ゲノム編集された細胞または前記ｉＰＳＣ誘導造血細胞が、以下
（ｉ）Ｂ２Ｍｎｕｌｌまたはｌｏｗ、
（ｉｉ）ＣＩＩＴＡｎｕｌｌまたはｌｏｗ、
（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇまたは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入された発現、
（ｉｖ）ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つにおける欠失または発現低下、
（ｖ）ＨＬＡ－Ｅ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ
２Ａ
Ｒ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャー、および二重特異的もしくは多重特異的またはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つにおける導入された発現または増加した発現、
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載のコンストラクト。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６４９，７８１号、２０１８年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７７４，０５２号、および２０１８年１２月２１日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６７２８９号の優先権を主張し、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,600 文字）【０００２】
電子的に提出された配列表への言及
本出願は、参照により、本出願とともに送信された、２０１８年３月２８日に作成された、４５，８６７バイトのサイズである、１３６０１－２０４－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと題する、ＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表のコピュター可読形式（ＣＲＦ）を組み込む。
【０００３】
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関する。より詳細には、本開示は、ｉｎｖｉｖｏで治療に適切な特性を送達することができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関する。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な制限に対処する。
【背景技術】
【０００４】
養子細胞療法の分野は現在、患者由来およびドナー由来の細胞を使用することに焦点が当てられているため、癌免疫療法の一貫した製造を達成することと、恩恵を受ける可能性のある全ての患者に療法を提供することとが特に困難なものとなっている。養子移入されたリンパ球の有効性と持続性を改善して、患者の良好な転帰を促進する必要もある。Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然免疫および適応免疫に重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためにこれらの免疫細胞を使用することは、依然として困難であり、改善に対する満たされていない要求が存在する。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞およびＮＫ細胞、または他のリンパ球の可能性を最大限に活用するための重要な機会が残っている。
【発明の概要】
【０００５】
応答率、細胞の消耗、輸注された細胞の損失（生存率および／または持続性）、標的の喪失または系統転換による腫瘍エスケープ、腫瘍の標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果、固形腫瘍に対する有効性、すなわち腫瘍微小環境および関連する免疫抑制、動員、輸送、および浸潤など、様々な問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。
【０００６】
本発明の目的は、単一細胞由来のｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）クローン株から分化した誘導非多能性細胞を生成する方法および組成物を提供することであり、このｉＰＳＣ株はそのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子改変を含む。前述の１つまたはいくつかの遺伝子改変には、ＤＮＡ挿入、欠失、および置換が含まれ、これらの改変は、分化、増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、継代および／または移植の後、その後の誘導細胞において保持され、機能し続ける。
【０００７】
本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞には、ＣＤ３４細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（造血幹細胞および前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞は、同一の遺伝子改変を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つまたはいくつかの遺伝子改変を含む。遺伝子操作された誘導細胞を取得するための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略では、指示された分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性が、ｉＰＳＣの操作されたモダリティによって悪影響を受けないこと、および操作されたモダリティが誘導細胞で意図したとおりに機能することも必要である。さらに、この戦略は、末梢血から取得されたＴ細胞またはＮＫ細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。さらに、この戦略は、最初は不均質である初代細胞源を使用して別の方法で取得される不均質のエフェクター細胞集団の生成を回避する。
【０００８】
本発明のいくつかの態様は、リプログラミングプロセスに続いて、同時に、およびその前に、それぞれ、ゲノム操作の戦略を反映する（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）を含む方法を使用して取得されたゲノム操作されたｉＰＳＣを提供する：
【０００９】
（Ｉ）：ｉＰＳＣを（ｉ）と（ｉｉ）のうちの一方または両方を任意の順序で遺伝子操作する：（ｉ）１つ以上のコンストラクト（複数可）をｉＰＳＣに導入して、選択した部位（複数可）で標的化された組み込みを可能にする；（ｉｉ）（ａ）選択された部位の認識が可能な１つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位（複数可）に１つ以上の二本鎖切断（複数可）をｉＰＳＣに導入する；（ｂ）ステップ（Ｉ）（ｉｉ）（ａ）のｉＰＳＣを培養し、内因性ＤＮＡ修復により、選択された部位（複数可）で標的化されたインデルを生成できるようにする；それにより、部分的または完全に分化した細胞への分化が可能なゲノム操作されたｉＰＳＣを取得する。
【００１０】
（ＩＩ）：リプログラミングされた非多能性細胞を遺伝子操作して、ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得する：（ｉ）非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、ならびに必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させ、非多能性細胞のリプログラミングを開始する；（ｉｉ）ステップ（ＩＩ）（ｉ）のリプログラミングされた非多能性細胞に（ａ）と（ｂ）のうちの一方または両方を任意の順序で導入する：（ａ）選択された部位（複数可）で標的化された組み込みを可能にする１つ以上のコンストラクト（複数可）；（ｂ）選択された部位の認識が可能な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼを使用して、選択された部位で１つ以上の二本鎖切断（複数可）を行った後、ステップ（ＩＩ）（ｉｉ）（ｂ）の細胞を培養して内因性ＤＮＡ修復をして選択された部位（複数可）で標的化されたインデルの生成を可能にする；したがって、取得されたゲノム操作されたｉＰＳＣは少なくとも１つの機能標的化されたゲノム編集を含み、前述のゲノム操作されたｉＰＳＣは部分的または完全に分化した細胞に分化することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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