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公開番号2025006951
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-17
出願番号2023108010
出願日2023-06-30
発明の名称ハプテンの測定方法
出願人デンカ株式会社
代理人弁理士法人平木国際特許事務所
主分類G01N 33/531 20060101AFI20250109BHJP(測定;試験)
要約【課題】ハプテンとキャリア蛋白質を結合する際にNHSエステル法を用いることで、ハプテンの測定においてハプテンの測定感度を向上させることができる、免疫測定法及び免疫測定法用試薬の提供。
【解決手段】ハプテンとキャリア蛋白質をNHSエステル法により結合させハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを作製し、
該ハプテン-キャリア蛋白質を用いてハプテンを測定する、ハプテンの測定方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ハプテンとキャリア蛋白質をNHSエステル法により結合させハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを作製し、
該ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを用いてハプテンを測定する、ハプテンの測定方法。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
ハプテンとキャリア蛋白質をNHSエステル法により結合させる方法において、ハプテンがアミノ基を有しているか、アミノ基が導入されたハプテンであり、DSG (disuccinimidyl glutarate)、DSS (disuccinimidyl suberate)、BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、TSAT (tris-(succinimidyl)aminotriacetate)、BS(PEG)5 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、BS(PEG)9 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))、 Lomant's Reagent、DST (disuccinimidyl tartrate)、EGS (ethylene glycol bis(succinimidyl succinate))及びSulfo-EGS (ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate))からなる群から選択される架橋剤を用いる、請求項１記載のハプテンの測定方法。
【請求項３】
ハプテンが3-O-(2-Aminoethyl)-25-hydroxyvitamin D3である、請求項１記載のハプテンの測定方法。
【請求項４】
免疫学的測定法である、請求項１記載のハプテンの測定方法。
【請求項５】
競合的免疫測定法である、請求項４記載のハプテンの測定方法。
【請求項６】
ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを担体に固相化し、担体に標識抗ハプテン抗体とハプテンを含む被検試料を添加し、標識抗ハプテン抗体への結合について、ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートとハプテンを競合させてハプテンを測定する、請求項５記載のハプテンの測定方法。
【請求項７】
凝集法である、請求項４記載のハプテンの測定方法。
【請求項８】
ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを結合させた粒子とハプテンを含む被検試料と抗ハプテン抗体を混合し、ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを結合させた粒子を抗ハプテン抗体を介して凝集させ、凝集の程度により被検試料中のハプテンを測定する、請求項７記載のハプテンの測定方法。
【請求項９】
ハプテンを測定するための試薬であって、NHSエステル法で結合させたハプテン-キャリア蛋白質を含む試薬。
【請求項１０】
ハプテンとキャリア蛋白質をNHSエステル法により結合させる方法において、ハプテンがアミノ基を有しているか、アミノ基が導入されたハプテンであり、DSG (disuccinimidyl glutarate)、DSS (disuccinimidyl suberate)、BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、TSAT (tris-(succinimidyl)aminotriacetate)、BS(PEG)5 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、BS(PEG)9 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))、 Lomant's Reagent、DST (disuccinimidyl tartrate)、EGS (ethylene glycol bis(succinimidyl succinate))及びSulfo-EGS (ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate))からなる群から選択される架橋剤を用いる、請求項９記載の試薬。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを用いてハプテンを測定する方法に関する。
続きを表示（約 3,500 文字）【背景技術】
【０００２】
医療分野において、生体成分から特定の物質を検出もしくは定量する方法として抗原抗体反応を利用した免疫測定法が広く利用されている。抗原抗体反応に基づく免疫測定法は、特異性が高くかつ検出感度も高いため、臨床検査の重要な手段の一つとなっている。この免疫測定法には、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）などが知られている。
【０００３】
これらの測定法を実施するにあたり、被測定物質に対する抗体又は抗原をマイクロタイタープレート、メンブレンフィルター、ラテックス粒子、金コロイドなどの水不溶性の固相に結合して使用するが、高感度で安定性の高い診断薬を製造するには抗体又は抗原を上記の水不溶性固相に効率的かつ安定性よく結合させる技術が非常に重要である。
【０００４】
上記のような水不溶性の固相（担体）に抗原又は抗体を結合させる方法には、主に物理吸着、共有結合等による方法が知られている。共有結合による方法に比べ、物理吸着法は簡便であり、かつ、吸着させる抗原又は抗体の活性を損なうことがないという利点を有する。しかしながら、抗原がハプテンのような低分子である場合、水不溶性固相との相互作用が弱いため、抗原を物理吸着させることは困難であった。
【０００５】
従来、上記の問題点を解決するため、ハプテンをキャリア蛋白質（高分子担体）に、架橋剤又はカップリング剤を使用して共有結合させる方法が知られている。特にハプテンに対する抗体を作製する場合に、ハプテンとキャリア蛋白質を結合させることが知られている（特許文献１参照）。この方法に用いるキャリア蛋白質としては、例えば、ウシの血清アルブミン、ヒトの血清アルブミン、卵のアルブミン、スカシガイヘモシアニン（キーホールリンペットヘモシアニン）、オボアルブミン、チログロブリン、フィブリノーゲン、ポリリジン等を用いることができる。
【０００６】
ハプテンと蛋白質は、それぞれの官能基により結合される。そして、ハプテンとの結合に用いる蛋白質の官能基は、ε-及びα-アミノ基（pKa10.8）、フェノール基、スルフヒドリル基、イミダゾール基、カルボキシル基などが挙げられる。ハプテンと蛋白質分子を架橋するために用いる架橋試薬（又は方法）としては、カルボキシル基活性化方法として、混合酸無水物法、カルボジイミド法、NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）エステル法などがあり、アミノ基活性化方法として、グルタルアルデヒド法（１段階又は２段階）、NHS法（マレイミド：スクシンイミド、スクシンイミド：スクシンイミド、スクシンイミド：2-ピリジルチオプロピオネート等）などがあり、チオール基活性化方法としてマレイミド法などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特表2001-516567号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ハプテンとキャリア蛋白質を結合する際にNHSエステル法を用いることで、ハプテンの測定においてハプテンの測定感度を向上させることができる、免疫測定法及び免疫測定法用試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ハプテンにキャリア蛋白質を結合する際にNHSエステル法を用いることで、ハプテンとキャリア蛋白質のコンジュゲートを用いてハプテンを測定するときの測定感度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] ハプテンとキャリア蛋白質をNHSエステル法により結合させハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを作製し、
該ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを用いてハプテンを測定する、ハプテンの測定方法。
[２] ハプテンとキャリア蛋白質をNHSエステル法により結合させる方法において、ハプテンがアミノ基を有しているか、アミノ基が導入されたハプテンであり、DSG (disuccinimidyl glutarate)、DSS (disuccinimidyl suberate)、BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、TSAT (tris-(succinimidyl)aminotriacetate)、BS(PEG)5 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、BS(PEG)9 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))、 Lomant's Reagent、DST (disuccinimidyl tartrate)、EGS (ethylene glycol bis(succinimidyl succinate))及びSulfo-EGS (ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate))からなる群から選択される架橋剤を用いる、[１]のハプテンの測定方法。
[３] ハプテンが3-O-(2-Aminoethyl)-25-hydroxyvitamin D3である、[１]のハプテンの測定方法。
[４] 免疫学的測定法である、[１]のハプテンの測定方法。
[５] 競合的免疫測定法である、[４]のハプテンの測定方法。
[６] ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを担体に固相化し、担体に標識抗ハプテン抗体とハプテンを含む被検試料を添加し、標識抗ハプテン抗体への結合について、ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートとハプテンを競合させてハプテンを測定する、[５]のハプテンの測定方法。
[７] 凝集法である、[４]のハプテンの測定方法。
[８] ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを結合させた粒子とハプテンを含む被検試料と抗ハプテン抗体を混合し、ハプテン-キャリア蛋白質コンジュゲートを結合させた粒子を抗ハプテン抗体を介して凝集させ、凝集の程度により被検試料中のハプテンを測定する、[７]のハプテンの測定方法。
[９] ハプテンを測定するための試薬であって、NHSエステル法で結合させたハプテン-キャリア蛋白質を含む試薬。
[１０] ハプテンとキャリア蛋白質をNHSエステル法により結合させる方法において、ハプテンがアミノ基を有しているか、アミノ基が導入されたハプテンであり、DSG (disuccinimidyl glutarate)、DSS (disuccinimidyl suberate)、BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、TSAT (tris-(succinimidyl)aminotriacetate)、BS(PEG)5 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、BS(PEG)9 (PEGylated bis(sulfosuccinimidyl)suberate)、DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))、 Lomant's Reagent、DST (disuccinimidyl tartrate)、EGS (ethylene glycol bis(succinimidyl succinate))及びSulfo-EGS (ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate))からなる群から選択される架橋剤を用いる、[９]の試薬。
[１１] ハプテンが3-O-(2-Aminoethyl)-25-hydroxyvitamin D3である、[９]の試薬。
[１２] さらに、抗ハプテン抗体を含む、免疫学的測定法用試薬である[９]の試薬。
[１３] さらに、抗ハプテン抗体を含む、凝集法用試薬である[９]の試薬。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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