特許ウォッチ

公開番号2024156661
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024104500,2022108721
出願日2024-06-28,2015-10-16
発明の名称多能性幹細胞を使用するヒト小腸のin vivoモデル、並びにそれを作製、及び使用する方法
出願人チルドレンズホスピタルメディカルセンター
代理人個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ヒト腸オルガノイド(HIO)に由来する、血管が張り巡らされている中空器官を作製するための方法を提供する。
【解決手段】血管が張り巡らされている中空器官を作製する方法であって、a)ヒト腸オルガノイド(HIO)を免疫不全の生物、好ましくは哺乳類、好ましくは免疫反応を有さない哺乳類、好ましくは重症複合免疫不全症(SCID)を有する哺乳類に移植する工程を有し、前記HIOはヒト胚幹細胞(ESC)及び/または人工多能性幹細胞(iPSC)から得られ、前記移植する工程の間に前記HIOが成熟腸組織を形成する、方法が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
血管が張り巡らされている中空器官を作製する方法であって、
ａ）ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を免疫不全の生物、好ましくは哺乳類、好ましくは免疫反応を有さない哺乳類、好ましくは重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有する哺乳類に移植する工程
を有し、前記ＨＩＯはヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）及び／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られ、
前記移植する工程の間に前記ＨＩＯが成熟腸組織を形成する、方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）が、ヒトＥＳＣ、もしくはｉＰＳＣ、またはそれらの組合せから作製される、方法。
【請求項３】
請求項１～２のいずれか記載の方法において、前記移植する工程が、前記免疫不全の生物の腎被膜への前記ＨＩＯの移植を有する、方法。
【請求項４】
請求項１～３のいずれか記載の方法において、前記移植する工程が、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、もしくは少なくとも約６週間、または最大で約３ヶ月、もしくは最大で約４ヶ月、もしくは最大で約５ヶ月、もしくは最大で約６ヶ月の期間にわたり実施される、方法。
【請求項５】
請求項１～４のいずれか記載の方法において、前記移植する工程は、前記腸組織が、
支持間葉に包囲される円柱腸上皮を有すること、
直径１～３ｃｍの成長、
機能的腸細胞を有する絨毛及び陰窩の形成、
粘膜下及び腸筋層間に平滑筋線維層を有すること、
並びにこれらの組合せ
から選択される１つまたはそれより多い基準を満たすまで実施される、方法。
【請求項６】
機能的腸神経系（ＥＮＳ）を含有するヒト腸組織を作製する方法であって、
ａ）ヒトＥＳ細胞及び／またはｉＰＳ細胞（ＩＰＣ）に由来する迷走神経様神経堤細胞（ＮＣＣ）を三次元ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）に接触させる工程と、
ｃ）前記ＨＩＯをｉｎｖｉｖｏで移植する工程と
を有する、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記ＮＣＣは、後部化を引き起こすため、ヒトＥＳ細胞及び／またはｉＰＳ細胞をレチノイン酸に接触させる工程によって取得され、好ましくは、前記レチノイン酸が前記ヒトＥＳ細胞及び／またはｉＰＳ細胞と約１～約２日間、好ましくは約２日間の期間にわたって接触される、方法。
【請求項８】
請求項６または７記載の方法において、前記レチノイン酸に接触させる工程が、ニューロスフェアステージにおいて約２日間にわたって、またはＨＯＸＢ３、ＨＯＸｂ５、及び／もしくはＨＯＸｂ７の実質的な発現が観察されるまで実行される、方法。
【請求項９】
請求項６～８のいずれか記載の方法において、前記移植する工程が、神経及び／または神経膠の検出を可能にするのに十分な期間にわたって実施される、方法。
【請求項１０】
請求項６～９のいずれか記載の方法において、前記神経がＢＩＩＩ－チューブリンを有する、方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、『ＩｎｖｉｖｏＭｏｄｅｌｏｆＨｕｍａｎＳｍａｌｌＩｎｔｅｓｔｉｎｅＵｓｉｎｇＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ』と題する、２０１４年１０月１７日に出願された米国出願第６２，０６５，１３１号に対する優先権、及びその出願の利益を主張する。
続きを表示（約 13,000 文字）【０００２】
政府支援条項
本発明は、ＤＫ０８３３２５、ＤＫ０９８３５０、ＮＳ０８０８１５、及びＤＫ０９２４５６の下での政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
腸などの血管が張り巡らされている中空器官の複雑性ゆえ、その研究、及び手術または病理過程後の置換のための、十分なヒトモデルの開発は、一見して不可能な課題であることが示されてきた。ヒト腸を研究するための方法は、主にｉｎｖｉｔｒｏ培養システムを主に必要とし、あるいは多数のトランスレーショナルな問いに取り組むために動物モデルに依存してきたが、これは必ずしもヒトでの研究においては上手く置き換えが効かない。古典的な腸上皮初代培養技術は、大概、器官培養、または幹細胞から分化細胞までの階層性を再現しない腸細胞株などの、組織培養技術に限定された。腸幹細胞、及びヒト上皮培養に適切な条件の最近の同定はこれらの障害の多くを克服したものの、粘膜傷害後にホストの間葉を露出させるモデルにおいて存在するような、支持間葉の必要性ゆえ、上皮培養のｉｎｖｉｖｏ移植の成功は難題であり続けている。
【０００４】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の器官特異的サブタイプへの分化は、胚発生及び疾患経過の研究のための、並びに薬学的研究のための、また治療用移植物のための潜在的供給源としての、興奮するような道筋を、提供する。今日まで、ヒト腸に対しては限定的なｉｎｖｉｖｏモデルしか存在しておらず、それらの全てが、生分解性スキャフォールド上に移植された、初代上皮培養、または、間葉系細胞を含む外科生検由来の消化された組織に依存する。
【０００５】
現在、血管が張り巡らされている中空器官、とくに腸神経系（ＥＮＳ）腸生物学の研究のためのモデルを作製するための方法ための技術に、需要がある。さらに、機能的腸神経系を有する腸組織を作製する方法のための技術に、需要がある。現在、ヒト腸を研究するための方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ培養システムを主に必要とし、あるいは動物モデルに依存してきた。しかしながら、これらの研究は必ずしも上手くヒトでの研究に置き換えが効かない。腸幹細胞、及びヒト上皮培養がこれらの問題のいくらかには取り組んできたものの、上皮培養のｉｎｖｉｖｏ移植の成功は、支持間葉が必要であることゆえ、課題であり続けている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）由来の、血管が張り巡らされている中空器官を作製するための方法が開示される。ＨＩＯは、ヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）、及び／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、ＨＩＯが成熟腸組織を形成するように、得られうる。機能的腸神経系（ＥＮＳ）を含有するヒト腸組織を作製するための方法も開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１Ａ～Ｅ。ＨＩＯ移植はｉｎｖｉｖｏで生着し、成熟腸組織を形成する。図１Ａ－ｈＰＳＣからのＨＩＯの発達、及び成熟ヒト長組織を生成するための腎被膜下への移植を表わす概要。図１Ｂ－支持間葉（白矢尻）により包囲される腸上皮（黒矢尻）からなる、３５日における２つのｉｎｖｉｔｒｏＨＩＯ。スケールバー、１００μｍ。図１Ｃ－６週間後の移植物（輪郭内）で、複雑な構造、及び確立した末梢毛細管ネットワークを有する。サイズ比較のため、マウス腎臓が移植物の下に示される。スケールバー、５ｍｍ。図１Ｄ－６週における移植物断面図で、中心内腔を有する腸構造を示す。スケールバー、５ｍｍ。図１Ｅ－移植物の内腔表面の拡大図で、各々が自身の中心毛細管を有する絨毛のシートを示す。スケールバー、５００μｍ。ｎ＝１３９移植物。
図２Ａ～Ｉ。移植された腸組織は、成人腸に類似し、ほぼ完全にヒト由来である。図２Ａ－移植されたＨＩＯのＨ&Ｅ染色後の、弱及び強拡大イメージング。低倍率イメージングは、上皮の複数部位、層状の平滑筋、及び末梢毛細管を示す。スケールバー、５００μｍ。高倍率イメージングは、陰窩－絨毛領域、並びに、粘膜固有層、粘膜筋板、粘膜下組織、及び外側平滑筋層を含む上皮下組織の適切な層を示す。図２Ｂ－移植物内の上皮のアルシアンブルー－過ヨウ素酸－Ｓｃｈｉｆｆ染色で、陰窩－絨毛軸内の分泌型細胞を表わす。黒矢尻は、陰窩底部内に存在する、ＰＡＳ標識されたパネート細胞を指す。図２Ｃ－移植物中には、腸細胞（ＶＩＬ）、杯細胞（ＭＵＣ２）、パネート細胞（ＬＹＳＯ、白矢尻、スケールバー５０μｍ）、及び腸内分泌細胞（ＣＨＧＡ）を含む４つの腸系細胞すべてが存在していた。追加の上皮染色にはＥ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）が使用された。図２Ｄ－ダブルコルチン様キナーゼ１（ＤＣＬＫ１）で標識されるように、上皮の至る所において刷子細胞もまた見られる。図２Ｅ－マウスホスト血管内殖のｍＭＥＣＡ－３２染色。図２Ｆ－上皮の陰窩底部、及び陰窩内の増殖性区画内の活発な増殖のＥｄｕ染色。図２Ｇ－ＶＩＭに対する染色は、支持間葉の寄与を明らかにし、これはα－ＳＭＡの染色を有する層状の平滑筋（白矢尻）を含む。マージ画像は、ＶＩＭ及びα－ＳＭＡでの二重染色を示し、支持ＩＳＥＭＦの陰窩周囲鞘を示す。図２Ｈ－２Ｉ－移植物の全厚みにわたるＨｕＮｕｃ染色によって評価される、ヒト上皮細胞（図２Ｈ）、及びヒト間葉組織（図２Ｉ）の寄与。点線は、移植物を下のマウス腎臓から分離する。全スケールバーは、別に特定される箇所を除き、１００μｍである。ｎ＝１３４移植物。
図３Ａ～Ｉ。移植された組織はｉｎｖｉｖｏで成熟し、成熟小腸に類似する。（図３Ａ～Ｄ）ＳＩＭ（図３Ａ）、ＤＰＰＩＶ（図３Ｂ）、ＬＣＴ（図３Ｃ）を含む刷子縁酵素の成熟、及び分化した腸内分泌細胞サブタイプ（ＧＩＰ）（図３Ｄ）を示す、移植された腸組織（ｉｎｖｉｖｏ）の免疫染色。追加の上皮染色には、ＥＣＡＤ及びＣＤＸ２が使用された。（図３Ｅ～Ｈ）比較のため、移植物に相当するタイムポイントにおける、ＳＩＭ（図３Ｅ）、ＤＰＰＩＶ（図３Ｆ）、ＬＣＴ（図３Ｇ）、またはＧＩＰ（図３Ｈ）に対する、ｉｎｖｉｖｏでのＨＩＯの染色。図３Ｉ。移植された（Ｔｘｐ）ＨＩＯとの比較での、ｉｎｖｉｔｒｏでのＨＩＯにおける、ＬＣＴ、ＳＩＭ、ＤＰＰＩＶ、及びＧＩＰの相対的遺伝子発現。グラフにおける値は、ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、ｔ検定。ＩｎｖｉｔｒｏでのＨＩＯ：ｎ＝４、移植物（Ｔｘｐ）：ｎ＝８。スケールバー、１００μｍ。
図４Ａ～Ｉ。マウスホストにおいては、回盲部切除後、移植されたヒト腸組織は、液性因子に応答する。（ａ）移植されたＨＩＯを有するマウスにおける切除実験を表わす、概要。図４Ｂ。シャム対ＩＣＲ群における、ネズミ上皮のＨ&Ｅ染色。シャム及びＩＣＲ群間の、マウス腸における、測定された絨毛高さ（μｍ、図４Ｃ）及び陰窩分裂のパーセンテージ（図４Ｄ）の比較。（図４Ｅ）シャム対ＩＣＲ群における、移植されたＨＩＯ上皮のＨ&Ｅ染色。シャム群対ＩＣＲ群における、移植されたＨＩＯ内の、絨毛高（図４Ｆ）及び陰窩分裂のパーセンテージ（図４Ｇ）の比較。（図４Ｈ）シャム及びＩＣＲ群における、Ｅｄｕを腸細胞増殖のマーカーとして使用する、免疫蛍光染色。ＥＣＡＤは上皮を染色するために使用される。（図４Ｉ）移植されたＨＩＯにおける、シャム及びＩＣＲ群間の、増殖指標（％）の比較。ここで、増殖指標＝Ｅｄｕ＋細胞数を腸陰窩内の合計細胞数で割ったもの。スケールバー、１００μｍ。グラフ中の値は、ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、＊＊＊Ｐは０．００１未満、ｔ検定。シャム群：ｎ＝４、ＩＣＲ群：ｎ＝８。
図５Ａ～Ｆ。ＨＩＯ産生のタイムライン／概要、サイズ及び移植効率。（ａ）ｈＰＳＣからのＨＩＯの３５日間にわたる分化誘導を表わす概要。図５Ｂ。中心上皮、及び周囲の支持間葉（輪郭内）を表わす、移植前のＨＩＯの写真。図５Ｃ。移植前の、Ｉ型コラーゲン中に埋め込まれた１つのＨＩＯ（輪郭内）の相対サイズ。図５Ｄ。微細鉗子を使用する、腎被膜下のポケットの生成。図５Ｅ。腎被膜下に移植されたＨＩＯの写真。図５Ｆ。移植後の、６週タイムポイントにおける移植の効率を示す表。
人工多能性幹細胞からのＨＩＯは、生着し、ｉｎｖｉｖｏで成熟ヒト腸組織を形成する。図６Ａ。人工多能性幹細胞に由来するＨＩＯを使用する移植後６週間の移植物。図６Ｂ。絨毛及び中心毛細管を有する移植物の内腔表面を表わす、移植物の拡大画像。図６Ｃ。移植物内の上皮の拡大Ｈ&Ｅ（スケールバー１００μｍ）。陰窩－絨毛領域、並びに、粘膜固有層、粘膜筋板、粘膜下組織、及び層状の外側平滑筋層を含む上皮下組織の適切な層が存在していた。（図６Ｄ～Ｇ）。移植物中には、腸細胞（ビリン－ＶＩＬ）（スケールバー１００μｍ）（図６Ｄ）、杯細胞（ムチン－ＭＵＣ２）（図６Ｅ）、パネート細胞（リゾチーム－ＬＹＳＯ）（図６Ｆ）、及び腸内分泌細胞（クロモグラニンＡ－ＣＨＧＡ）（図６Ｇ）を含む、４つの腸系細胞すべてが存在していた。追加の上皮染色については、Ｅ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）またはＣＤＸ２が使用された。（特定されている箇所を除き、全てのスケールバー５０μｍ）。
６週における移植された組織の透過電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。図６Ａ。腸上皮表面上の刷子縁微絨毛のＴＥＭ画像。この画像においては、先端面付近に、密着及び接着結合もまた見られる（スケールバー５００ｎｍ）。図６Ｂ。ムチンを含有する分泌顆粒（白）を有する、杯細胞のＴＥＭ画像（スケールバー２μｍ）。図６Ｃ。細胞の基底側面上に放出の準備が整った分泌顆粒（暗）を有する、腸内分泌細胞のＴＥＭ画像（スケールバー２μｍ）。図６Ｄ。並行方向の平滑筋線維を有する、移植物内の平滑筋のＴＥＭ画像（スケールバー１０μｍ）。
移植されたＨＩＯ対ｉｎｖｉｔｒｏのＨＩＯにおける、追加の上皮及び間葉の成熟マーカー。（図８Ａ～Ｇ）ＥｐＣＡＭ（図８Ａ）、ビリン－ＶＩＬ（図８Ｂ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＩ）（図８Ｃ）、リゾチーム（ＬＹＺ）（図８Ｄ）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）（図８Ｅ）、ムチン（ＭＵＣ２）（図８Ｆ）、及びグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）（図８Ｇ）を含む、上皮マーカーの相対的遺伝子発現の比較。（図８Ｈ～Ｉ）平滑筋マーカーである、デスミン（ＤＥＳ）（図８Ｈ）及び平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）（図８Ｉ）の相対的発現。グラフ中の値は、Ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、ｎｓは、非有意。＊はｐは０．０５未満、＊＊はｐは０．０１未満、＊＊＊はｐは０．００１未満、ｉｎｖｉｔｒｏのＨＩＯ：ｎ＝４、移植物（Ｔｘｐ）：ｎ＝８。
移植された組織は、腸幹細胞により維持される成熟上皮を示した。（図９Ａ～Ｄ）ＬＧＲ５Ｒ５：ｅＧＦＰＢＡＣレポーターＥＳ株が確立され、ＬＧＲ５－ｅＧＦＰ細胞を発現するＨＩＯを作製するために使用された、図９Ａ。ＬＧＲ５－ｅＧＦＰ細胞（緑）は、ｉｎｖｉｔｒｏでＨＩＯ内に、上皮の至る所に散在して見られた（図９Ｂ）。また、ＬＧＲ５－ｅＧＦＰ細胞（緑）は、移植されたヒト腸組織において、予期されるように、増殖型陰窩底部細胞中に局在している（ＫＩ６７との共局在）（図９Ｃ～Ｄ）。図９Ｅ。移植物の陰窩底部内に局在する、幹細胞マーカーＡＳＣＬ２（緑）の免疫蛍光染色。図９Ｆ。グラフは、移植前のｉｎｖｉｔｒｏでのＨＩＯ内の、及び移植物中における、ＬＧＲ５及びＡＳＣＬ２の、相対変化倍率を示した。図９Ｇ。組織の幹細胞性を示すため、移植された上皮からエンテロイドが作製された。図９Ｈ。パネルは、初めの播種後第１、５、及び１０日、並びに継代後における、移植物由来の上皮エンテロイドを示す。（図９Ｉ～Ｋ）。免疫蛍光染色は、ビリン（ＶＩＬ）及びＥ－カドヘリン（ＥＣＡＤ）（図９Ｉ）を有する上皮細胞の存在、並びに、パネート細胞（リゾチーム－ＬＹＳＯ）（図９Ｊ）及び刷子縁酵素（ジペプチジルペプチダーゼ４－ＤＰＰＩＶ）（図９Ｋ）の存在を明らかにした（全てのスケールバーは５０μｍ）。
移植された腸組織は、血液供給をネズミ血管の内殖から受けた。図１０Ａ。マウス特異的な汎内皮抗体（ｍＭＥＣＡ－３２）を使用して、移植物の表面のすぐ下の（図１０ｂ）、並びに移植物の内部中のネズミ血管を明らかにした（白矢尻、スケールバー５０μｍ）。図１０Ｃ。各絨毛内の血管、並びに移植物内で上皮のすぐ下の毛細管叢を有する、ｍＭＥＣＡ－３２染色された内皮（緑）の、拡大免疫蛍光画像。図１０Ｄ。マウス尾静脈によるＦＩＴＣ標識トマトレクチンの注射の後の、腎臓内移植物のホールマウント染色。輪郭内領域１及び２は、それに続く、移植物内の機能的蛍光ネズミ血管を表わす画像に対応する（スケールバー５０μｍ）。図１０Ｅ。移植物内上皮の、ネズミ特異的（ｍＭＥＣＡ－３２）及びヒト特異的（ｈＣＤ３１）染色を表わす、免疫蛍光画像。図１０Ｆ。ホールマウント移植物に対する共焦点画像は、マウス科血管とヒト血管との間の連結を示さなかった。図１０Ｇ。ネズミ特異的リンパ管マーカー（ＬＹＶＥ－１）は、ネズミホストからのリンパ管の内殖を示した。（特定される箇所を除き、全てのスケールバーは１００μｍ）。
ＮＳＧマウスにもまた、外科的切除、並びにＨＩＯ移植の後、腸の適合が起こる。図１１Ａ。切除後のマウス小腸における陰窩分裂（輪郭内）の拡大画像。（スケールバー５０μｍ）。図１１Ｂ。術後ＩＣＲ組織における、平滑筋層（筋層）の厚み増加（スケールバー５０μｍ）。図１１Ｃ。術前、シャム、及び切除（ＩＣＲ）群間の、ネズミ腸陰窩深度（μｍ）の比較。図１１Ｄ。術前、シャム、及び切除（ＩＣＲ）群間の、平滑筋層の厚み（μｍ）の比較。図１１Ｅ。シャムマウスにおけるＨＩＯ移植物中の腸上皮の拡大画像（スケールバー５０μｍ）。図１１Ｆ。ＩＣＲマウスにおけるＨＩＯ移植物中の陰窩分裂の拡大画像（スケールバー５０μｍ）。グラフ中に示される値はＭｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わす。ｎｓは、非有意。＊はｐは０．０５未満、＊＊はｐは０．０１未満、＊＊＊はｐは０．００１未満、術前群：ｎ＝１３、シャム群：ｎ＝１０、ＩＣＲ群：ｎ＝１１。
移植されたヒト腸組織は、消化及び吸収機能を維持した。図１２Ａ。腸アルカリホスファターゼは、ｅｘｖｉｖｏで活性を示した（スケールバー１００μｍ）。図１２Ｂ。Ｉｎｖｉｖｏで移植物に注射されたＦＩＴＣ－デキストラン（ＭＷ４，４００）（写真は前と後に観察）は、ネズミ血清において、初めの３０分のタイムポイントから、４時間のタイムポイントと比較して、各マウス内で有意に増加した（ｎ＝７）。グラフ中に示される値はＭｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、ｎｓは、非有意、＊はｐは０．０５未満、＊＊はｐは０．０１未満、＊＊＊はｐは０．００１未満、対応のあるｔ検定。図１２Ｃ。移植物の上皮内のペプチドトランスポーター（ＰＥＰＴ１）染色を表わす、Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡペプチド取込み解析（スケールバー１００μｍ）。図１２Ｉ。媒体（ＤＭＥＭ溶液）、Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ（ＤＭＥＭ＋標識ペプチド溶液）、及びカプトプリル＋Ｄ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＡＭＣＡ（ＤＭＥＭ＋標識ペプチド溶液＋輸送溶液の競合阻害剤）の注射後の、上皮内の蛍光を表わす、追加の画像（各群についてｎ＝３）。標識ペプチド（ｉｉｉ）の注射後は蛍光が観察されたが、媒体注射（ｉｉ）では、または標識ペプチド＋カプトリル注射（ｉｖ）では、蛍光は殆どから全く観察されなかった。
ｉＰＳＣについての品質管理解析。標準的なフィーダーなしの条件で培養されたｉＰＳＣコロニーの位相コントラスト画像。図１３Ｂ。ｉＰＳＣにおける多能性マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの免疫蛍光染色。図１３Ｃ。対象ｉＰＳＣの正常（４６、ＸＹ）核型を示す、Ｇバンド核型解析。図１３Ｄ。ｉＰＳＣ由来テラトーマのＨ&Ｅ染色切片は、３つの胚性胚葉、すなわち内胚葉、外胚葉、及び中胚葉から生じる組織を示した。対照テラトーマは、初期歯に一致する抗基底核を有する末梢上皮（外胚葉）、腸に一致する線毛円柱上皮（内胚葉）、及び軟骨細胞（中胚葉）により包囲される星状の細網細胞を示した。画像は、倍率４００倍である。
迷走神経様神経堤細胞（ＮＣＣ）の作製。１４Ａ－Ｈｏｘ遺伝子を発現する神経堤細胞を作製するためのプロトコールの略図。本方法は頭部ＮＣＣ９を生成することが報告されているが、ニューロスフェア培養の最後の４８時間の間のレチノイン酸の添加は、後部／迷走神経様ＮＣＣのマーカーである、ＨｏｘＡ２、Ｂ３、Ｂ５、及びB７を誘導する。図１Ｂ－ＮＣＣは、星状の形態を示し、表面マーカーＨＮＫ－１、ｐ７５ＮＴＲ、及びＲＥＴが陽性であった。図１４Ｃ－神経板境界、及び神経堤細胞指定の調節因子の、定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析。図１Ｄ－ニューロスフェアのＲＡでの４８時間にわたる処理は、迷走神経レベルのＨＯＸ遺伝子を発現するＮＣＣの形成をもたらす。より後部のＨＯＸ遺伝子Ｂ３、５、及び７は、用量依存的な発現レベルの上昇を示した（データ表示なし）。スケールバー１００μＭ。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０１未満、＊＊Ｐは０．００１未満、スチューデントのｔ検定（両側、対応なし）、条件あたりｎ＝３の生物学的レプリケート、データは３つの独立な実験の代表。
図１５Ａ～Ｃ。発達中のＨＩＯ中へのＮＣＣのｉｎｖｉｔｒｏでの組み込み。図１５Ａ－ＨＩＯ中にＮＣＣを組み込むための概要。ＨＩＯ及びＮＣＣは別々に作製され、低速遠心法により併せられ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込まれ、ｉｎｖｉｔｒｏで４週間育てられた。場合によっては、ＨＩＯはＮＳＧマウス中に移植され、ｉｎｖｉｖｏで６～８週間育てられた。図１５Ｂ－ＨＩＯのｉｎｖｉｔｒｏ成長。左パネル－２８ｄＨＩＯ＋／－ＮＣＣの明視野画像。スケールバー、１ｍｍ。中央パネル－神経（βＩＩＩ－チューブリン）及び上皮（Ｅ－カドヘリン）の免疫染色。右パネル－神経膠細胞（Ｓ１００＋）及び上皮（Ｅ－カドヘリン）の免疫染色。スケールバー、１００μｍ。データはＨＩＯをＮＣＣとｉｎｖｉｔｒｏで併合する１４の独立な実験の代表。図１５Ｃ－ＨＩＯ＋ＮＣＣのｉｎｖｉｖｏ成長。ＨＩＯ＋ＮＣＣが、ＮＳＧマウスの腎被膜下スペースへと移植され、６週間育てられた。左パネルは、直径～１ｃｍであったＨＩＯ＋ＮＣＣを示す。スケールバー、１ｍｍ。中央パネルは、ＨＩＯ－ＮＣＣ中で互いに直角に方向付けられる、筋腸間様配置での、平滑筋線維（デスミン＋）に隣接する神経形成を示し、ＥＮＳの非存在下で平滑筋の分化が起こることを示す。デスミン＋細胞の第二層は、上皮に対し粘膜下に位置する。ＨＩＯ＋ＮＣＣは、デスミン＋平滑筋層内に埋め込まれ、かつ筋腸間神経叢に非常に類似する構成を有する、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン＋）を含有する。右パネルは、神経膠細胞（Ｓ１００＋）もまた、粘膜下層を含むＨＩＯ＋ＮＣＣの間葉層内に埋め込まれることを示す。
図１６Ａ～Ｂ。神経多様性、及びＣａｊａｌ間質細胞（ＩＣＣ）の形成。図１６Ａ。ｉｎｖｉｔｒｏで培養されたＨＩＯ＋ＮＣＣ（上パネル）における、またｉｎｖｉｖｏでの移植後（下パネル）の、ＥＮＳ神経の神経化学マーカーを使用する、異なる神経細胞種の解析。ドパミン作動性神経（ＴＨ）、介在神経（ＣｈＡＴ、５－ＨＴ）、感覚神経（カルビンジン）、興奮性神経（カルレチニン）、及び抑制性神経（ｎＮＯＳ）は、いずれも、ｉｎｖｉｖｏ移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおいて見られた。これに対し、ｉｎｖｉｔｒｏのＨＩＯ＋ＮＣＣは、抑制性神経（ｎＮＯＳ）を含有せず、これは本質的に胚性であったことを示唆する。図１６Ｂ。ｉｎｖｉｖｏでのＨＩＯ＋ＮＣＣにおけるＣａｊａｌ間質細胞（ＣＤ１７７－赤）の形成。ＮＣＣなしでのＨＩＯは、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン－緑）を形成せず、より少ないＣＤ１１７＋細胞を有した。これは、ＩＣＣの分化には、ＮＣＣが関与しうることを示唆する。
図１７Ａ～Ｄ。ＨＩＯ＋ＮＣＣにおける神経活動のライブイメージング。図１７Ａ。ＧＣａＭＰ６ｆ発現性ＰＳＣから産生されるＮＣＣを、Ｈ１ＰＳＣから産生されるＨＩＯと併合するための、プロトコールの略図。図１７Ｂ。神経堤由来のＥＮＳ細胞におけるＣａ２＋流動のライブイメージングは、周期的活動を示す。ＨＩＯ＋ＮＣＣ中の神経活動を示す、２０分間の低速度動画からのスナップショット。色付矢印は、ピクセル強度が経時的に測定され図１７Ｃにおいて示されるセルを指し示す。図１７Ｃ。番号付スナップショットは、図１７Ｂにおける矢尻に対応し、ＨＩＯ＋ＮＣＣ培養中の単一神経の脱分極の律動的な波を示す（最初の３つのタイムポイントのみが図１７Ｂには示された）。グラフは、Ｃａ２＋流動に関連するピクセル強度を測定する。線の色は、スナップショットにおける同色の矢尻に対応する。図１７Ｄ。ＫＣｌは、カルシウム流出の波を誘導する。ＫＣｌ実験からのピクセル強度の定量は、ＫＣｌが、速く幅広いＥＮＳ細胞の脱分極の波を誘導することを示す。
図１８Ａ～Ｃ。運動性を制御する３次元の粘膜下及び筋腸間神経叢の形成。図１８Ａ。ヒト腸、及びＨＩＯ＋ＥＮＳ組織の、ホールマウント免疫染色、及び３－Ｄイメージング。ヒト粘膜下組織及びＨＩＯ＋ＥＮＳの正面図で、平滑筋線維（デスミン）を統合し平滑筋線維（デスミン）とともに方向付けられる神経膠叢への、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン）及び神経膠（Ｓ１００）のアレンジメントを示す。ＨＩＯ＋ＥＮＳ組織もまた、平滑筋線維とともに方向付けられる神経膠叢を含有した。図１８Ｂ－腸及び粘膜下神経叢の形成。左パネル－ｉｎｖｉｖｏ移植されたＨＩＯ＋ＮＣＣの正視図は、上皮（ｄａｐｉ－青）周辺での神経膠（Ｓ１００）の密接な連携を示す。右パネル－ホールマウント画像の側面図は、２つの神経叢を明確に同定する。１つは上皮粘膜と連携し（粘膜下神経叢）、もう１つは平滑筋の外層（筋腸間神経叢）と連携する。図１８Ｃ。ＨＩＯ中のＥＮＳは、蠕動様収縮を媒介する。Ｉｎｖｉｖｏで育てられた組織が、Ｔｙｒｏｄｅ溶液中へと外殖され、電界刺激（ＥＦＳ）にかけられた。高電圧ＥＦＳ（１００Ｖにて１ｍｓパルス）にかけられたＨＩＯ－ＥＮＳは、１つの単一収縮が起きた（ｎ＝２）。低電圧ＥＦＳ（５０Ｖにて１ｍｓパルス）にかけられたＨＩＯ＋ＥＮＳは、持続する一連の波様の収縮が起きた（ｎ＝５）。その持続する一連の波様の収縮は、組織がテトロドトキシン中で培養されると失われた（ＨＩＯ＋ＥＮＳ＋ＴＴＸ、ｎ＝２）。
図１９Ａ～Ｅ。収縮活動の、ＥＮＳ依存的、及び非依存的な制御。図６Ａ。移植されたＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＥＮＳ組織片における、自発的収縮の記録。組織平衡化（刺激なし）後に相動性収縮が観察された。これは、Ｃａｊａｌ間質細胞（ＩＣＣ）がＨＩＯ（ｎ＝７）及びＨＩＯ＋ＥＮＳ（ｎ＝７）組織の両者に存在することを示唆する。図１９Ｂ。メチレンブルーでのＩＣＣ活性阻害が収縮性活動の喪失をもたらすことを示す記録（ｎ＝３）。図１９Ｃ－左パネルは、ＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＥＮＳにおけるジメチルフェニルピペラジニウム（ＤＭＭＰ）刺激の、代表的な画像を示す。右パネルは、刺激前後に２分間にわたり測定された、ＤＭＰＰ（１０μＭ）刺激間の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す（ｎ＝７）。図６Ｄ－ＥＮＳ活性化のＴＸＸ阻害。ＨＩＯ＋ＥＮＳにおける、刺激後に２分間にわたり測定された、ＤＭＰＰ刺激間の曲線下面積で、続いてテトロドトキシン（ＴＸＸ、１０μＭ）処理された（ｎ＝７）。図１９Ｅ－ＮＯ依存的メカニズムによる、ＥＮＳ依存的緩和。ＨＩＯ＋ＥＮＳにおける、刺激後２分間にわたり測定された、ＤＭＰＰ刺激間の曲線下面積で、続いてＮＧ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ）処理された（ｎ＝７）。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、Ｍａｎｎ&Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。
発生中の神経堤細胞の特性決定。図２０Ａ。第６日の自由に浮遊しているニューロスフェアは、直径およそ５００μｍであり、ＰＡＸ６、ビメンチン、及びＳＯＸ９陽性である。これは、神経堤細胞、及び神経堤細胞が生じる外側神経板の特徴である。図２０Ｂ。ニューロスフェアはフィブロネクチン基質に接着し、明視野顕微鏡で可視である神経ロゼットを生じた。接着したニューロスフェアは広くにわたりＰＡＸ６を発現した一方、ビメンチン染色は、ＮＣＣが離層している神経ロゼットの縁にて観察された。ＮＣＣがロゼットから離れるように遊走すると、ＰＡＸ６は下方制御され、一方でＳＯＸ２発現は維持された。
ヒト及びヒヨコのＮＣＣの振る舞いの比較。（図２１Ａ及び図２１Ｂ）ヒヨコ胚からの頭部（Ｈｏｘ陰性）及び体幹（Ｈｏｘ陽性）ＮＣＣの単離及び培養、並びにＨｏｘ遺伝子発現の解析。前部ニワトリ神経管から単離されたＮＣＣはＨｏｘ遺伝子を発現しない一方、後部神経管から単離されたものはＨｏｘＢ７陽性であった。（図２１Ｃ）ニワトリ頭部ＮＣＣは、４８時間にわたり２μＭのＲＡで処理されると、迷走神経レベルのＨｏｘ遺伝子ＨｏｘＢ７及びＨｏｘＢ７を発現する。別の後部化因子であるＦＧＦ４は、Ｈｏｘ遺伝子発現には影響を及ぼさなかった。（図２１Ｄ）ヒトＰＳＣ由来のＮＣＣのニワトリ胚への移植を記す概要。ＧＦＰ標識されたヒトＮＣＣが、ＨＨ１０－１２ニワトリ胚へと体節間に卵内注入された。（図２１Ｅ）胚は、～ＨＨ３８にて解析された。ＧＦＰ標識細胞は、神経管（ＮＴ）に沿って側方に遊走し、前腸（ＦＧ）にてコロニー形成していることが見いだされた。（図２１Ｆ）ＧＦＰ標識細胞の末梢神経（ペリフェリン）への分化（背側が右、前部が上）。
頭部ＮＣＣ及びＲＡ処理ＮＣＣの分化ポテンシャル。図２２Ａ。ヒトＰＳＣ由来のＮＣＣの、神経膠系細胞、並びに間葉系細胞（骨細胞、及び軟骨細胞）へのｉｎｖｉｔｒｏ分化。頭部ＮＣＣ及びＲＡ処理ＮＣＣは、ｉｎｖｉｔｒｏでは、同等に、神経膠系細胞（ペリフェリン、及びＧＦＡＰ）、骨細胞（アリザリンレッド）、及び軟骨細胞（アルシアンブルー）を形成する能力があった。図２２ｂ。頭部様ＮＣＣは、ｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏで色素上皮（矢尻）を形成し、これは神経上皮を形成する能力が維持されていることを示唆する。
ヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）の作製、及びＮＣＣ遊走合図の発現。図２３Ａ。ヒト多能性幹細胞の分化誘導により、ＨＩＯを作製する方法。図２３Ｂ。ＨＩＯ発生の各段階における分化マーカーの一時的発現。アクチビンＡは、胚体内胚葉（ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７）への効率的な分化、ＷＮＴ活性化、並びに単一層及び自由に浮遊しているスフェロイドにおけるＦＧＦ４誘導性ＣＤＸ２発現を媒介した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ中での４週間にわたるスフェロイドの育成は、ＣＤＸ２発現性ＨＩＯの形成をもたらした。ＨＩＯは、マウスの被膜下スペース中へと移植され、そこで６週間後には、成長して成熟し、陰窩及び絨毛を有する腸組織を形成した。ヒト特異的抗体ＨｕＮｕは、腸上皮及び間葉がヒト起源であることを示す。図２３Ｃ。Ｉｎｖｉｔｒｏで形成されたＨＩＯは、ＧＤＮＦ及びＥＤＮ３を発現した。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、＊Ｐは０．０５未満、＊＊Ｐは０．０１未満、ｔ検定（両側、対応なし）、ｎ＝３（生物学的レプリケート）、データは２つの独立な実験の代表。
ＨＩＯ＋ＮＣＣ培養物における神経及び神経膠は、ＮＣＣ由来である。ＮＣＣが、ＧＦＰを広範に発現するＨ９－ＧＡＰＤＨ－ＧＦＰヒト胚幹細胞から作製され、Ｈ１ＨＥＳＣから作製されたＨＩＯと併合された。ＨＩＯは、ＧＦＰ、及び汎神経マーカーＰＧＰ９．５または神経膠マーカーＳ１００で共染色された。ＨＩＯ＋ＮＣＣにおける神経膠細胞は、ＧＦＰと神経膠マーカーとの共発現により証明されるように、ＮＣＣ由来である。
神経節様構造が、ｉｎｖｉｖｏで育成されたＨＩＯ＋ＮＣＣにおいて形成する。（図２４Ａ）免疫染色された切片において、神経（ＢＩＩＩ－チューブリン）は筋腸間神経叢の至る所に広がっていた。また、出願人は、神経節に類似の、クラスター状の神経細胞体（ＨｕＣ／Ｄ）を観察した。（図２４Ｂ）。神経（ＢＩＩＩ－チューブリン、正面図）及び神経細胞体（ＨｕＣ／Ｄ、側面図）に対するホールマウント免疫染色は、ＨＩＯ＋ＮＣＣにおける、神経節様クラスターへと組織化された神経細胞体を示す。
移植されたＨＩＯ、及びＨＩＯ＋ＮＣＣ組織の、自発的収縮の記録。
（図２７Ａ）左パネルは、ＨＩＯ及びＨＩＯ＋ＮＣＣにおけるベラトリジン刺激の代表的な記録を示す。右パネルは、刺激の前後２分間にわたり測定された、ベラトリジン（３μＭ）刺激間の曲線下面積（ＡＵＣ）を表わす（ｎ＝５）。（図２７Ｂ）刺激の前後２分間にわたり測定された、ジメチルフェニルピペラジニウム（ＤＭＭＰ、１０μＭ）刺激間の曲線下面積を表わし、続いてテトロドトキシン（ＴＸＸ、１０μＭ）処理された（ｎ＝３）。（図２７Ｃ）刺激後２分間にわたり測定された、ＤＭＭＰ刺激間の曲線下面積を表わし、続いてＮＧ－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（ＬＮＡＭＥ）処理された（ｎ＝３）。（ｄ）左パネル、ＨＩＯ（ｎ＝４）及びＨＩＯ＋ＮＣＣ組織（ｎ＝１４）の両者における、ニトロプルジドナトリウム（ＳＮＰ）刺激後の代表的な記録。右パネル、刺激前後２分間にわたり測定された、ＳＮＰ刺激間の曲線下面積。グラフ中の値はｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ．を表わし、Ｍａｎｎ&Ｗｈｉｔｎｅｙ検定。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
胃腸（ＧＩ）管の腸神経系（ＥＮＳ）は、運動性、上皮浸透性、及び流体交換を制御する。ＥＮＳ発生または機能における不調は一般的であるが、ＥＮＳ－腸の生物学を研究するためのヒトモデルが欠如している。
【０００９】
出願人は、ヒト胚幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から、ｉｎｖｉｖｏで生着しうるヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）を、ｉｎｖｉｔｒｏで作製した。これらのＨＩＯは、腸幹細胞を有する成熟腸上皮を形成する。その腸幹細胞は、陰窩絨毛構造、及び層状のヒト間葉に寄与し、その両者がマウス血管内殖により支持される。出願人は、ｉｎｖｉｖｏ移植が、上皮及び間葉の著しい増殖及び成熟をもたらすことを示した。これは、ｉｎｖｉｔｒｏでのＨＩＯと比較した場合の、異なる腸細胞系列（腸細胞、杯細胞、パネート細胞、刷子細胞、及び腸内分泌細胞）、機能的刷子縁酵素（ラクターゼ、スクロースイソメラーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼ４）の存在、並びに可視の上皮下及び平滑筋層により示された。出願人はさらに、移植された腸組織が、浸透性及びペプチド取込み実験により証明される、消化機能を呈することを示した。移植されたＨＩＯ由来組織は、回盲部切除後、ホストマウスからの全身性シグナルに応答することが分かった。このことは、腸の適応応答において、循環性因子が役割を有することを示唆する。
【００１０】
出願人はさらに、機能的ＥＮＳを有する、ヒトＰＳＣ由来の腸組織を開発した。機能的ＥＮＳを含有するヒト腸組織を作製するため、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を用いる組織工学的手法を使用して、出願人は、ＰＳＣ由来の神経堤細胞（ＮＣＣ）を発生中のヒト腸オルガノイド（ＨＩＯ）と併合することにより、正常な腸ＥＮＳ発生を再現した。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許