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公開番号2025079493
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-22
出願番号2023192201
出願日2023-11-10
発明の名称核酸配列情報のフィルタリング方法
出願人株式会社豊田中央研究所
代理人個人,個人
主分類C12Q 1/6869 20180101AFI20250515BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】全ゲノム配列が未解読である特定生物を、生物由来核酸源とする場合に、解析対象である核酸配列情報から特定生物由来の核酸配列を効率よく除去する。
【解決手段】核酸配列情報のフィルタリング方法は、全ゲノム配列が未解読である第1特定生物からゲノムDNAを抽出し、抽出したゲノムDNAを用いてゲノムリードを取得し、ゲノムリードを用いてコンティグを生成し、データベースを用いた相同性検索を行って、第1特定生物と同じ科に属する近縁生物を特定し、第1特定生物等の特定生物類に付着等した生物由来核酸を特定生物類から回収し、回収した生物由来核酸から核酸リードを取得し、近縁生物のゲノム配列をリファレンス配列としてマッピングを行い、リファレンス配列上にアライメントされた核酸リード以外の残余の核酸リードを解析対象の核酸配列情報として取得する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
核酸配列情報のフィルタリング方法であって、
全ゲノム配列が未解読である第１特定生物から、ゲノムＤＮＡを抽出し、
抽出した前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記ゲノムＤＮＡを断片化して得た核酸配列であるゲノムリードを取得し、
前記ゲノムリードを用いてde novoアセンブリを行って、前記第１特定生物のゲノムＤＮＡの部分配列であるコンティグを生成し、
ゲノム配列情報を含むデータベースと前記コンティグの配列情報とを用いた相同性検索を行って、前記データベースに前記ゲノム配列情報が格納された生物のうち、前記第１特定生物と同じ科に属する生物であって、相同性があると判断するために予め定めた基準を満たすコンティグの数が最も多い生物を含む近縁生物を特定し、
前記第１特定生物、または、前記第１特定生物と同じ科に属して全ゲノム配列が未解読である第２特定生物である特定生物類に付着した生物由来核酸、あるいは、前記特定生物類の体内に存在する生物由来核酸を前記特定生物類から回収し、回収した生物由来核酸から、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって塩基配列が読まれた核酸リードを取得し、
前記近縁生物のゲノム配列をリファレンス配列として、前記核酸リードを用いたマッピングを行い、前記リファレンス配列上にアライメントされた前記核酸リード以外の残余の核酸リードを、解析対象の核酸配列情報として取得する
核酸配列情報のフィルタリング方法。
続きを表示（約 690 文字）【請求項２】
請求項１に記載の核酸配列情報のフィルタリング方法であって、
前記相同性検索は、生成された前記コンティグのうち、前記ゲノムリードによる平均カバレッジが予め定めた基準値以上のコンティグを用いて行う
核酸配列情報のフィルタリング方法。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸配列情報のフィルタリング方法であって、
前記特定生物類として魚類を用いる
核酸配列情報のフィルタリング方法。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸配列情報のフィルタリング方法であって、
前記de novoアセンブリは、ショットガンメタゲノム解析におけるシーケンシングにより得られた核酸配列情報の総量が２Ｇｂ以上であるゲノムリードを用いて行う
核酸配列情報のフィルタリング方法。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸配列情報のフィルタリング方法であって、
前記近縁生物として、前記予め定めた基準を満たすコンティグの数が多い順に３種以上の生物を特定し、
特定した前記３種以上の近縁生物のゲノム配列を前記リファレンス配列として用いる
核酸配列情報のフィルタリング方法。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸配列情報のフィルタリング方法であって、
前記特定生物は、移動性の生物であり、
前記核酸リードは、前記特定生物類に付着した生物由来核酸、あるいは、前記特定生物類から排出された物質に含まれる生物由来核酸から取得される
核酸配列情報のフィルタリング方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸配列情報のフィルタリング方法に関する。
続きを表示（約 5,900 文字）【背景技術】
【０００２】
特定の環境下で生息する生物の多様性などを調査するために、調査対象である環境中から生物由来核酸を含む環境核酸を回収し、回収した生物由来核酸を解析する作業が進められている。生物由来核酸を解析するためには、上記特定の環境を構成するある程度広い範囲から生物由来核酸を回収する必要があるが、例えば池の水などの環境水や大気中から生物由来核酸を回収しようとすると、生物由来核酸が希薄な状態で存在するために、生物由来核酸の十分な回収および解析が困難となり得る。このような問題を解決する方法の一つとして、例えば、魚類や鳥類など、環境水や大気などの環境中を移動する生物、あるいはこのような生物に由来する物質から、これらの生物に付着あるいは取り込まれるなどして濃縮された生物由来核酸を回収して解析する方法が考えられる。しかしながら、上記のような生物由来核酸の回収源となる生物（以下では、「ホスト生物」とも呼ぶ）等から回収した生物由来核酸は、ホスト生物由来の核酸を多く含むことになる。生物多様性を調査するためには、例えば微生物やウイルス等の多様性を解析することが重要となるため、解析処理の軽減や解析効率の向上のために、回収した生物由来核酸の核酸配列情報から、ホスト生物に由来する核酸の配列情報（以下、「ホスト配列情報」とも呼ぶ）を除外して解析することが望まれる。
【０００３】
特定生物から生物由来核酸を回収して解析する際に、生物由来核酸の回収源である特定生物の核酸配列情報を除外する方法として、例えば、ハチのマイクロバイオーム（微生物集団）解析のための技術が知られている。具体的には、ハチの体表や体内からＤＮＡを抽出して塩基配列を読み取り、得られた塩基配列を既知のハチゲノム配列にマッピングして、マッピングされた塩基配列を除去することによって、抽出したＤＮＡの核酸配列情報からハチの核酸配列情報（特定生物の核酸配列情報）を除去し、残りの核酸配列情報を用いてマイクロバイオームを解析する技術が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、類似する技術として、ヒトから生物由来核酸を回収して核酸配列情報を得て、得られた核酸配列情報から既知のヒトゲノム配列情報を除去し、残余の核酸配列情報を用いて、ヒトから回収した生物由来核酸中の病原体や腸内細菌などに係る核酸配列情報を解析する技術が知られている。例えば、患者から核酸サンプルを回収して核酸配列情報を得て、得られた核酸配列情報から既知のヒトゲノム配列情報を除去し、残余の核酸配列情報を用いて新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の解析を行う技術が提案されている（例えば、非特許文献２参照）。さらに、関連する技術として、核酸配列情報から核酸の回収源であるヒト由来のＤＮＡの配列情報を除去するためのツール（フレームワーク）が提案されている（例えば、非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
Katherine D. Chau et al., "Integrative population genetics and metagenomics reveals urbanization increases pathogen loads and decreases connectivity in a wild bee", Global Change Biology, (2023) 29, 4193-4211. DOI:10.1111/gcb.16757
Sun Zhaoyang et al., "Clinical characteristics of the host DNA-removed metagenomic next-generation sequencing technology for tectiong SARS-CoV-2, revealing host local immune signaling and assisting genomic epidemiology", Frontiers in Immunology, 15 November 2022, DOI:10.3389/fimmu.2022.1016440
Robert Schmieder et al., "Fast Identification and Removal of Sequence Contamination from Genomic and Metagenomic Datasets", PLoS ONE, March 2011;6(3).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した従来知られる技術では、生物由来核酸の回収源である特定生物（上記したハチやヒト）の全ゲノム配列は既知であり、このような特定生物のゲノム配列情報を解析対象である核酸配列情報から除去することは比較的容易であった。これに対して、任意の環境の生物多様性を調査する場合などでは、環境中に生息する生物から選択されるホスト生物の全ゲノム配列が未解読である場合が想定され、このような場合には、従来知られる技術を適用して解析対象である核酸配列情報からホスト配列情報を十分に除去することが困難になる。ホスト生物の全ゲノム配列が未解読であるために、解析対象である核酸配列情報からホスト配列情報を除去することができないと、ホスト配列情報を含む核酸配列情報全体を解析する必要が生じるが、例えば魚類の体表から回収した核酸の配列情報には、ホスト生物由来の配列が８０％前後含まる可能性があり、解析効率が低下する。そのため、全ゲノム配列が未解読である特定生物を、生物由来核酸の回収源とする場合であっても、解析対象である核酸配列情報から上記特定生物の核酸配列を効率よく除去する（フィルタリングする）技術が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
（１）本開示の一形態によれば、核酸配列情報のフィルタリング方法が提供される。この核酸配列情報のフィルタリング方法は、全ゲノム配列が未解読である第１特定生物から、ゲノムＤＮＡを抽出し、抽出した前記ゲノムＤＮＡを用いて、前記ゲノムＤＮＡを断片化して得た核酸配列であるゲノムリードを取得し、前記ゲノムリードを用いてde novoアセンブリを行って、前記第１特定生物のゲノムＤＮＡの部分配列であるコンティグを生成し、ゲノム配列情報を含むデータベースと前記コンティグの配列情報とを用いた相同性検索を行って、前記データベースに前記ゲノム配列情報が格納された生物のうち、前記第１特定生物と同じ科に属する生物であって、相同性があると判断するために予め定めた基準を満たすコンティグの数が最も多い生物を含む近縁生物を特定し、前記第１特定生物、または、前記第１特定生物と同じ科に属して全ゲノム配列が未解読である第２特定生物である特定生物類に付着した生物由来核酸、あるいは、前記特定生物類の体内に存在する生物由来核酸を前記特定生物類から回収し、回収した生物由来核酸から、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって塩基配列が読まれた核酸リードを取得し、前記近縁生物のゲノム配列をリファレンス配列として、前記核酸リードを用いたマッピングを行い、前記リファレンス配列上にアライメントされた前記核酸リード以外の残余の核酸リードを、解析対象の核酸配列情報として取得する。
この形態の核酸配列情報のフィルタリング方法によれば、全ゲノム配列が未解読である特定生物類から回収した生物由来核酸より取得した核酸リードを解析する際に、第１特定生物と同じ科に属して第１特定生物のゲノム配列と高い相同性を示すと考えられる近縁生物のゲノム配列をリファレンス配列としてマッピングを行い、アライメントされなかった核酸リードを取得することによって、核酸リードのフィルタリングを行う。そのため、生物由来核酸源である特定生物類の全ゲノム配列が未解読であっても、特定生物類から回収した生物由来核酸の解析等を行う際に、生物由来核酸源である特定生物類のゲノム配列情報を効率的に除去することができる。そのため、生物由来核酸中で比較的多くの割合を占める生物由来核酸源（特定生物類）由来の核酸配列情報を除外して、効率よく解析を行うことができる。
（２）上記形態の核酸配列情報のフィルタリング方法において、前記相同性検索は、生成された前記コンティグのうち、前記ゲノムリードによる平均カバレッジが予め定めた基準値以上のコンティグを用いて行うこととしてもよい。このような構成とすれば、第１特定生物の真のゲノム配列の一部を構成する精度がより高いコンティグを用いて、相同性検索を行うことができる。
（３）上記形態の核酸配列情報のフィルタリング方法において、前記特定生物類として魚類を用いることとしてもよい。このような構成とすれば、解析対象である核酸リードの配列情報から、生物由来核酸源である特定生物類由来のゲノム配列を除去する動作を、効率よく行うことができる。
（４）上記形態の核酸配列情報のフィルタリング方法において、前記de novoアセンブリは、ショットガンメタゲノム解析におけるシーケンシングにより得られた核酸配列情報の総量が２Ｇｂ以上であるゲノムリードを用いて行うこととしてもよい。このような構成とすれば、de novoアセンブリに供する第１特定生物のゲノムの配列情報量を十分に確保することが可能になる。
（５）上記形態の核酸配列情報のフィルタリング方法において、前記近縁生物として、前記予め定めた基準を満たすコンティグの数が多い順に３種以上の生物を特定し、特定した前記３種以上の近縁生物のゲノム配列を前記リファレンス配列として用いることとしてもよい。このような構成とすれば、生物由来核酸から取得した核酸リードにから、生物由来核酸源である特定生物類のゲノム配列情報を除去する効率を高めることができる。
（６）上記形態の核酸配列情報のフィルタリング方法において、前記特定生物は、移動性の生物であり、前記核酸リードは、前記特定生物類に付着した生物由来核酸、あるいは、前記特定生物類から排出された物質に含まれる生物由来核酸から取得されることとしてもよい。このような構成とすれば、特定生物が生息する環境中の生物由来核酸が特定生物に付着するなどにより濃縮されるため、特定生物から生物由来核酸を取得して得た核酸リードを用いることで、特定生物が生息する環境を効率よく解析することが可能になる。
本開示は、上記以外の種々の形態で実現可能であり、例えば、生物由来核酸の解析方法、生物多様性の調査方法などの形態で実現することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
第１実施形態の核酸配列情報のフィルタリング方法を表すフローチャート。
第２実施形態の核酸配列情報のフィルタリング方法を表すフローチャート。
硬骨魚にヒットしたコンティグに関するｂｌａｓｔ検索結果を示す説明図。
ヤリタナゴ体表のＲＮＡ－ｓｅｑリードをマッピングした結果を示す説明図。
ヤリタナゴ体表のＲＮＡ－ｓｅｑリードをマッピングした結果を示す説明図。
分割したゲノムリードグループに関するｂｌａｓｔ検索結果を示す説明図。
分割したゲノムリードグループに関するｂｌａｓｔ検索結果を示す説明図。
分割したゲノムリードグループに関するｂｌａｓｔ検索結果を示す説明図。
分割したゲノムリードグループに関するｂｌａｓｔ検索結果を示す説明図。
種々のＲＮＡ－ｓｅｑリードをマッピングした結果を示す説明図。
主な淡水魚３９種類の系統樹を示す説明図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
Ａ．第１実施形態：
図１は、本開示の第１実施形態としての核酸配列情報のフィルタリング方法を表すフローチャートである。第１実施形態の核酸配列情報のフィルタリング方法は、全ゲノム配列（染色体ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの配列であり、植物の場合にはさらに葉緑体ＤＮＡの配列を含む）が未解読である第１特定生物から生物由来核酸を回収し、回収した生物由来核酸の解析等を行う際に、回収した生物由来核酸の配列情報から、第１特定生物のゲノム配列情報を除去するのと同様のフィルタリング効果を得るための方法である。
【００１０】
本実施形態の核酸配列情報のフィルタリング方法は、例えば、調査対象である環境中から生物由来核酸を含む環境核酸を回収し、回収した環境核酸を解析することによって、調査対象である環境下で生息する生物の多様性などを調査するために用いることができる。具体的には、調査対象である環境中に生息する第１特定生物を生物由来核酸の回収源（ホスト生物）として用い、ホスト生物から生物由来核酸を回収して解析する際に、本実施形態の核酸配列情報のフィルタリング方法を適用することができる。ホスト生物としては、例えば魚類、鳥類、昆虫類など、環境水や大気などの環境中を移動する移動性の生物を用いることができる。ホスト生物からの環境核酸の回収の動作は、例えば、ホスト生物に付着した環境核酸を、ホスト生物の体表や、体表からの脱離物（魚類の鱗や鳥類の羽根など）から回収することにより行うことができる。あるいは、ホスト生物からの環境核酸の回収の動作は、ホスト生物に取り込まれた環境核酸を、ホスト生物の消化管内容物などの体内物質やホスト生物の排泄物等から回収することにより行ってもよい。また、ホスト生物として移動性を有しない植物等を用いる場合には、ホスト生物から環境中に放出されて移動する種子や胞子、あるいは、ホスト生物から脱離して環境中を移動する生物体の一部（落ち葉など）から、生物由来核酸を回収することとしてもよい。
（【００１１】以降は省略されています）

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