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公開番号2025081929
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-28
出願番号2023195039
出願日2023-11-16
発明の名称試料製造方法
出願人国立大学法人新潟大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/24 20060101AFI20250521BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ボトムアッププロテオミクスにおいて、ロスの発生を抑制しつつ、簡便な操作でペプチド試料を得ることができる試料製造方法を提供する。
【解決手段】試料製造方法は、容器に接着した細胞に、有機溶媒を添加することで細胞を固定する工程(S1)と、固定した細胞にタンパク質分解酵素を添加する工程(S4)とを含んでいる。試料製造方法は、さらに、細胞を固定する工程(S1)よりも後で、且つタンパク質分解酵素を添加する工程(S4)よりも前に、細胞内のDNAを切断する工程を含んでいてもよい。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
容器に接着した細胞に、有機溶媒を添加することで細胞を固定する工程と、
固定した細胞にタンパク質分解酵素を添加する工程とを含む、試料製造方法。
続きを表示（約 390 文字）【請求項２】
細胞を固定する工程よりも後で、且つ前記タンパク質分解酵素を添加する工程よりも前に、細胞内のＤＮＡを切断する工程を含む、請求項１に記載の試料製造方法。
【請求項３】
細胞を固定する工程よりも後で、且つ細胞内のＤＮＡを切断する工程よりも前に、前記容器内の細胞数をカウントする工程を含み、
前記タンパク質分解酵素を添加する工程で、カウントされた細胞数に比例した量の前記タンパク質分解酵素を添加する、請求項１又は２に記載の試料製造方法。
【請求項４】
前記有機溶媒がアルコールである、請求項１又は２に記載の試料製造方法。
【請求項５】
前記有機溶媒がメタノールである、請求項４に記載の試料製造方法。
【請求項６】
前記容器が、ポリリジンでコートされている、請求項１又は２に記載の試料製造方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボトムアッププロテオミクスに用いる試料製造方法に関する。
続きを表示（約 1,200 文字）【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の有するタンパク質を網羅的に解析するために、ボトムアッププロテオミクスという技術が広く用いられている。
【０００３】
ボトムアッププロテオミクスでは、細胞から得られたペプチド試料を、液体クロマトグラフィーでペプチドの種類ごとに分離し、質量分析する。
【０００４】
近年、液体クロマトグラフィーや質量分析計は飛躍的な進歩を遂げており、短時間で非常に多くのペプチド試料を解析できるようになっている。
【０００５】
一方で、非特許文献１には、細胞からペプチド試料を取得するための従来の方法が記載されている。非特許文献１の方法では、接着培養した細胞をウェル等の容器から剥がしてペレットに凝縮した後、ＳＤＳ（ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ、ドデシル硫酸ナトリウム）を添加して細胞を溶かし、有機溶媒を用いてタンパク質を沈殿させ、ＳＤＳを除去する。こうして得られたタンパク質を尿素中で再可溶化し、タンパク質分解酵素で処理することで、ペプチド試料を得ることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
David P. et al., Quantitative Proteomics of the Cancer Cell Line Encyclopedia. Cell, 180, 387-402, 2020.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載された従来の方法では、細胞を容器から剥がして凝集する工程と、細胞をＳＤＳで溶解する工程と、細胞から出た液からＳＤＳを除去してタンパク質を回収する工程と、回収されたタンパク質を再び可溶化する工程と、タンパク質を分解酵素で処理する工程が必要であり、さらに別途、容器から剥がされた細胞の数をカウントすることが一般的であるため、特に多数のペプチド試料を調製する場合には操作者に多大な負担が掛かっていた。
【０００８】
また、細胞をペレットに凝集する過程やタンパク質を回収する過程でタンパク質のロスが発生してしまうという問題もあった。
【０００９】
このような事情に鑑みて、本発明は、ボトムアッププロテオミクスにおいて、ロスの発生を抑制しつつ、簡便な操作でペプチド試料を得ることができる試料製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ウェル等の容器で培養している細胞に対し、有機溶媒を加えることによって、ＳＤＳなどの界面活性剤で細胞を溶解することなく、その後の酵素処理に細胞を供することができることを発見し、本発明を完成させた。
（【００１１】以降は省略されています）

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