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公開番号2025069623
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-01
出願番号2023179446
出願日2023-10-18
発明の名称発光タンパク質
出願人国立大学法人大阪大学
代理人弁理士法人平木国際特許事務所
主分類C12N 15/62 20060101AFI20250423BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】複数の波長域で高光度に発光する、発光タンパク質を提供する。
【解決手段】バクテリアルシフェラーゼと蛍光タンパク質との複合体を含み、前記バクテリアルシフェラーゼはLuxAサブユニット及びLuxBサブユニットを有し、前記蛍光タンパク質はLuxAサブユニットを介してバクテリアルシフェラーゼと融合している、発光タンパク質。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
バクテリアルシフェラーゼと蛍光タンパク質との複合体を含み、前記バクテリアルシフェラーゼはＬｕｘＡサブユニット及びＬｕｘＢサブユニットを有し、前記蛍光タンパク質はＬｕｘＡサブユニットと融合している、発光タンパク質。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記ＬｕｘＡサブユニットが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の発光タンパク質。
【請求項３】
前記ＬｕｘＢサブユニットが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の発光タンパク質。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質が、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質から選択される、請求項１に記載の発光タンパク質。
【請求項５】
前記シアン蛍光タンパク質が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号３で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が４５０～５００ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；
前記緑色蛍光タンパク質が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５００～５２０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；
前記黄色蛍光タンパク質が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号５で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５２０～５５０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；
前記橙色蛍光タンパク質が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５５０～５８０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；又は、
前記赤色蛍光タンパク質が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５８０～６２０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である、
請求項４に記載の発光タンパク質。
【請求項６】
バクテリアルシフェラーゼのＬｕｘＡと蛍光タンパク質との融合体をコードする塩基配列を含む、核酸。
【請求項７】
さらに、バクテリアルシフェラーゼのＬｕｘＢをコードする塩基配列を含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸が組み込まれた、発現用ベクター。
【請求項９】
バクテリアルシフェラーゼのＬｕｘＡと蛍光タンパク質との融合体をコードする塩基配列を有する核酸、及びＬｕｘＢをコードする塩基配列を有する核酸が導入された、細胞。
【請求項１０】
細菌、真菌細胞、植物細胞又は動物細胞である、請求項９に記載の細胞。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光バクテリア由来のルシフェラーゼを含む発光タンパク質に関する。
続きを表示（約 4,200 文字）【背景技術】
【０００２】
ルシフェラーゼと呼ばれる触媒酵素により発光基質が酸化される発光現象のうち、生物内にて起こるものは生物発光と分類される。生物発光を示す生物は数千種類知られており、その中には、ルシフェラーゼ及び発光基質が同定されており、これらは、例えば、遺伝子工学にて光を指標として細胞中のタンパク質等を定量する目的で使用されている。
【０００３】
真正細菌（細菌、バクテリア）には、発光を生じる種（発光バクテリア）が複数存在する。発光バクテリアにおける光生成は、バクテリア由来のルシフェラーゼによって触媒される、基質の酵素反応によって生じる（非特許文献１及び２）。バクテリア由来のルシフェラーゼは、具体的には、還元フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ
２
）及び長鎖脂肪アルデヒド（ＲＣＨＯ）を酸化して、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及び対応する長鎖脂肪酸（ＲＣＯＯＨ）を生成するが、この反応時に、４９０ｎｍ付近に極大波長を有する光が発生する。
【０００４】
発光バクテリアの発光に必要な基本的な酵素は、ｌｕｘＣＤＡＢＥという単一のオペロン（ｌｕｘオペロン）によってコードされており、このオペロンは、発光バクテリアのすべての種に見られる（非特許文献１及び２）。ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢは、それぞれ、バクテリアルシフェラーゼのヘテロ二量体タンパク質のα（ＬｕｘＡ）サブユニット及びβ（ＬｕｘＢ）サブユニットをコードする。ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ及びｌｕｘＥは、ルシフェラーゼの基質である脂肪アルデヒドを合成し、再循環させるための複合体をコードする遺伝子である。発光バクテリア以外の細菌又は酵母細胞で、上記の５つのｌｕｘ遺伝子を共発現することにより、外部からの基質の供給を要することなく、自発的な発光現象（自発光）を示すことが観察された（非特許文献３及び４）。哺乳動物細胞又は植物細胞においては、上記の５つのｌｕｘ遺伝子に加えて、ＦＭＮオキシドレダクターゼ（ＬｕｘＧ）を共発現させることで、十分な量のＦＭＮＨ
２
を生成することができ、これにより、安定な生物発光が可能となる（非特許文献５－８）。
【０００５】
生物発光イメージングは、蛍光タンパク質によるイメージングとは異なり、外部からの励起光を必要としないため、光毒性、光退色、試料由来の蛍光バックグラウンド等の問題が活性し難い、という利点を有する。特に、バクテリアルシフェラーゼに基づくレポーターは、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が高く、かつ取り扱いが容易である、という利点も有する。また、励起光のスペクトル分析への干渉が生じないため、蛍光タンパク質よりも広いスペクトル範囲の解析が可能である。一方で、バクテリア由来の生物発光イメージングは、低輝度である、露光時間が長い、といった課題があり、その利用が制限されてきた（非特許文献９及び１０）。
【０００６】
非特許文献１１には、バクテリア由来のＬｕｘＢと円順列変異を導入した黄色蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓとを融合することにより、細胞内で生物発光共鳴エネルギー移動（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ（ＢＲＥＴ））を生じさせ、Ｌｕｘ単独と比較して、短時間で１０倍もの発光強度を達成できたことが記載されている。さらに、これを植物細胞及び動物細胞に導入することで、これらの細胞においても高光度化を達成したことも明らかにされた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
Meighen, E., A., Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991)
Dunlap, P., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 144, 37-64 (2014)
Frackman, S. et al., J. Bacteriol. 172, 5767-5773 (1990)
Gupta, R. K. et al., FEMS Yeast Res. 4, 305-313 (2003)
Close, D. M. et al., PLoS One 5, e12441 (2010)
Krichevsky, A. et al., PLoS One 5, e15461 (2010)
Xu, T. et al., PLoS One 9, e96347 (2014)
Gregor, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116, 26491-26496 (2019)
Close, D. M. et al., J. Biomed. Opt. 16, 047003 (2011)
Gregor, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115, 962-967 (2018)
Kaku, T. et al., Nature Scientific Reports, 11, 14994 (2021)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の通り、バクテリア由来のｌｕｘオペロンを利用し、さらに蛍光タンパク質ＶｅｎｕｓをｌｕｘＢと融合させることで、細胞内において高光度で自発光可能な発光タンパク質を構築できることが示された。この系で発生する光は、黄緑色（極大波長５２８ｎｍ）であるが、複数種のレポーターを要する細胞実験等に使用するには、異なる波長の光を発する複数種の発光タンパク質の存在が望まれる。
【０００９】
本発明は、複数の波長域で高光度に発光する、発光タンパク質を提供することを目的とする。また、本発明は、複数の波長域で高光度に発光する発光タンパク質について、これをコードする核酸、該核酸を組み込んだベクター、及び該核酸を組み込んだ細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下を提供する。
［１］バクテリアルシフェラーゼと蛍光タンパク質との複合体を含み、前記バクテリアルシフェラーゼはＬｕｘＡサブユニット及びＬｕｘＢサブユニットを有し、前記蛍光タンパク質はＬｕｘＡサブユニットと融合している、発光タンパク質。
［２］前記ＬｕｘＡサブユニットが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］に記載の発光タンパク質。
［３］前記ＬｕｘＢサブユニットが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］又は［２］に記載の発光タンパク質。
［４］前記蛍光タンパク質が、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、橙色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質から選択される、［１］～［３］のいずれかに記載の発光タンパク質。
［５］前記シアン蛍光タンパク質が、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号３で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が４５０～５００ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；前記緑色蛍光タンパク質が、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５００～５２０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；前記黄色蛍光タンパク質が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号５で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５２０～５５０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；前記橙色蛍光タンパク質が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５５０～５８０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である；又は、前記赤色蛍光タンパク質が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、若しくは配列番号７で表されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有し、かつ、極大蛍光波長が５８０～６２０ｎｍにある蛍光を発する機能を有するポリペプチド、又はこれらのいずれかのポリペプチドの循環置換体である、［４］に記載の発光タンパク質。
［６］バクテリアルシフェラーゼのＬｕｘＡと蛍光タンパク質との融合体をコードする塩基配列を含む、核酸。
［７］さらに、バクテリアルシフェラーゼのＬｕｘＢをコードする塩基配列を含む、［６］に記載の核酸。
［８］［６］又は［７］に記載の核酸が組み込まれた、発現用ベクター。
［９］バクテリアルシフェラーゼのＬｕｘＡと蛍光タンパク質との融合体をコードする塩基配列を有する核酸、及びＬｕｘＢをコードする塩基配列を有する核酸が導入された、細胞。
［１０］細菌、真菌細胞、植物細胞又は動物細胞である、［９］に記載の細胞。
［１１］バクテリアルシフェラーゼのＬｕｘＡと蛍光タンパク質との融合体をコードする塩基配列を有する核酸、及びＬｕｘＢをコードする塩基配列を有する核酸を発現させることを含む、発光タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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