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公開番号2024136632
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-04
出願番号2023047791
出願日2023-03-24
発明の名称脱分化脂肪細胞を製造する方法
出願人TOPPANホールディングス株式会社,国立大学法人大阪大学
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/077 20100101AFI20240927BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる新規な方法を提供すること。
【解決手段】天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも1種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、
前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
続きを表示（約 150 文字）【請求項２】
前記被覆材料がフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシン及びその塩並びにポリジアリルジメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記天井培養が血清を含む培地中で行われる、請求項１又は２に記載の方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱分化脂肪細胞を製造する方法に関する。
続きを表示（約 2,000 文字）【背景技術】
【０００２】
脱分化脂肪細胞は成熟脂肪細胞を天井培養することによって得られ（特許文献１）、間葉系幹細胞に類似した多分化能を有することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
国際公開第２００４／１１１２１１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の各発明を包含する。
［１］
天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程を含み、前記天井面の少なくとも一部が細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている、脱分化脂肪細胞を製造する方法。
［２］
前記被覆材料がフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ポリリシン及びその塩並びにポリジアリルジメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載の方法。
［３］
前記天井培養が血清を含む培地中で行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、成熟脂肪細胞から脱分化脂肪細胞がより効率的に得られる新規な方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は脱分化プロセスの観察結果を示し、（Ａ）は天井面が被覆されていない培養容器を用い、天井培養開始から０日、３日又は７日時点における脱分化プロセスの顕微鏡観察結果を示し、（Ｂ）は当該天井培養開始から７日時点における、ＣＤ９０及びＹＡＰにより脱分化脂肪細胞を免疫蛍光染色した画像、Ｈｏｅｃｈｓｔ対比染色により核（Ｎｕｃｌｅｉ）を可視化した画像、並びに、脱分化脂肪細胞のＣＤ９０、ＹＡＰ及び核の共局在を示すマージ画像を示す。
図２はＦＢＳ濃度が異なる条件で天井培養を行うことで得られた脱分化脂肪細胞の観察結果を示し、（Ａ）はＦＢＳ濃度が０ｖ／ｖ％、１０ｖ／ｖ％又は２０ｖ／ｖ％であるＤＭＥＭ高グルコース培地を用いた条件で１週間天井培養した際のＤＦＡＴ比の結果を示し、（Ｂ）はＦＢＳ濃度が異なる培地で７日間天井培養して得られたＤＦＡＴの位相差画像を示す。
図３は２０ｖ／ｖ％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてインキュベーションしたときにカチオン性ポリマーで被覆した面上に吸着したタンパク質の量を示す。
図４は蛍光標識した被覆材料で被覆したウェル表面の共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像及び各ウェルの中心を通る直線において蛍光強度を測定した結果を示す。
図５は蛍光標識した被覆材料で被覆した表面における蛍光強度の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。本明細書に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
【０００９】
本実施形態に係る脱分化脂肪細胞を製造する方法は、天井面を備える培養容器内で成熟脂肪細胞を天井培養して脱分化脂肪細胞を得る工程（天井培養工程）を含む。当該方法において、天井面の少なくとも一部は細胞外マトリックス及びカチオン性ポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の被覆材料によって被覆されている。
【００１０】
＜成熟脂肪細胞＞
成熟脂肪細胞は脂肪組織を構成する細胞であり、脂肪滴を含み培地中で浮遊する性質を有する細胞である。脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド（中性脂肪）、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の１重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質（ペリリピン等）の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が２０μｍ以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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