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公開番号2024129413
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-09-27
出願番号2023038609
出願日2023-03-13
発明の名称T細胞受容体遺伝子再構成断片(TREC)、Igκ鎖遺伝子再構成断片(KREC)およびSMN1遺伝子の量を定量PCRにより同時に測定する方法およびそのための新規プライマー
出願人KMバイオロジクス株式会社,国立大学法人熊本大学
代理人個人,個人,個人
主分類C12Q 1/686 20180101AFI20240919BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】TREC、KRECおよびSMN1の量を同時に測定するための方法、それを使用した検査方法、およびそのキットを提供する。
【解決手段】T細胞受容体遺伝子再構成断片(TREC)、Igκ鎖遺伝子再構成断片(KREC)およびSMN1遺伝子の量を定量PCRにより同時に測定する方法であって、以下:
(i)対象から採取されたDNAとPCR試薬を混合する工程であって、ここで前記PCR試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程;
(ii)定量PCR反応を行い、TREC、KRECおよびSMN1遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号4、5、7、10、37、および38で示される塩基配列を含む6つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号22、23、および28で示される塩基配列を含む3つのプローブを含む、方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法であって、以下：
（ｉ）対象から採取されたＤＮＡとＰＣＲ試薬を混合する工程であって、ここで前記ＰＣＲ試薬がプライマーのセット、およびプローブのセットを含む、工程；
（ｉｉ）定量ＰＣＲ反応を行い、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を定量する工程、
を含み、
ここで、前記プライマーのセットが、配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含み、かつ前記プローブのセットが、配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含む、
方法。
続きを表示（約 740 文字）【請求項２】
前記３つのプローブが蛍光物質およびクエンチャーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象から採取されたＤＮＡが、乾燥血液ろ紙に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プライマーのセットの６つのプライマーおよびプローブのセットの３つのプローブから選択される少なくとも１つの核酸が核酸修飾をさらに含む、請求項１－３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１－４のいずれか一項で規定される方法で測定されたＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量に基づき、正常検体と比較した場合に、以下のリスクを評価する検査方法であって：
ＴＲＥＣが低い場合にＴ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＫＲＥＣが低い場合にＢ細胞減少症のリスクがあると評価し；
ＴＲＥＣが低い場合に重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）のリスクがあると評価し；または
ＳＭＮ１が低い場合に脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）のリスクがあると評価する、
検査方法。
【請求項６】
カットオフ値が、ＳＭＡについて２００．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＴＲＥＣについて２０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満、ＫＲＥＣについて１０．０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ未満である、請求項５に記載の検査方法。
【請求項７】
配列番号４、５、７、１０、３７、および３８で示される塩基配列を含む６つのプライマーを含むプライマーのセット、および配列番号２２、２３、および２８で示される塩基配列を含む３つのプローブを含むプローブのセットを含む、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１の量を同時に測定するためのキット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般にＴ細胞受容体遺伝子再構成断片（ＴＲＥＣ）、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（ＫＲＥＣ）およびＳＭＮ１遺伝子の量を定量ＰＣＲにより同時に測定する方法に関する。
続きを表示（約 3,700 文字）【背景技術】
【０００２】
新生児スクリーニングは、新生児に対する先天性代謝異常等についての集団検診である。新生児スクリーニングの目的は、生まれつき特定の栄養素を利用できないとか、成長ホルモンなどが過不足の状態となり、その結果知的障害や身体の発育に障害を起こす遺伝性疾患等について、早期発見・早期治療により未然に心身障害を予防することである。具体的なスクリーニング方法では、まず産科医療機関で生後４～６日目の新生児のかかとから、ごく少量の血液をろ紙（ｄｒｉｅｄｂｌｏｏｄｓｐｏｔ；ＤＢＳ）に採り、スクリーニングセンターに郵送する。その後、スクリーニングセンターで乾燥血液ろ紙から抽出した試料から各種測定が行われる。
【０００３】
日本では、１９７７年１０月より検査料の公費負担による国の事業として新生児マススクリーニングが開始されている。現在日本における新生児マススクリーニングの対象疾患は、糖代謝異常症であるガラクトース血症、内分泌疾患である先天性甲状腺機能低下症や先天性副腎過形成症、アミノ酸代謝異常疾患であるフェニールケトン尿症やメイプルシロップ尿症、有機酸代謝異常疾患であるメチルマロン酸血症やプロピオン酸血症、脂肪酸代謝異常疾患であるＶＬＣＡＤやＭＣＡＤなどの合計２０疾患となっている。一方で、新生児マススクリーニングの対象になっていない、５つの条件を満たす疾患について、オプションで選択できる有料検査として、拡大スクリーニング（オプショナルスクリーニングとも呼ばれる）検査がある。５つの条件は、（ａ）治療法がある、（ｂ）その病気であるかの可能性を調べる精度の高い検査方法がある、（ｃ）先天性代謝異常症の中でも比較的に患者数が多い、（ｄ）病気が発症する前にみつけると治療効果を高め症状を事前に予防したり、重い障害を防ぐことができる、（ｅ）特徴的な症状が少なく、通常の診療で見つけることが難しい、である。
拡大スクリーニングとしては、ライソゾーム病、重症複合免疫不全症（severe combined immunodeficiency：以下、「ＳＣＩＤ」という）および脊髄性筋委縮症（spinal muscular atrophy：以下、「ＳＭＡ」という）に関するものがある。
【０００４】
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）は先天性免疫不全症の一つであり、液性および細胞性免疫の複合免疫不全症の最重症型と位置付けられる。通常生後数か月以内に日和見感染を含む様々な重症感染症を発症し、根本的治療である造血幹細胞移植を行わなければ生後１年以内に死亡する。発症頻度はおよそ５万出生あたり１人と推定されている。現在までにＳＣＩＤの病態の理解が進み、約２０の原因遺伝子が同定されている。ＳＣＩＤは造血幹細胞移植によって治癒しうるが、感染症を合併していると移植成績は不良となるため、いかに感染症罹患前に診断できるかが重要である（非特許文献１）。
【０００５】
正常なＴ細胞が新たに造られる場合、通常Ｔ細胞では遺伝子の再構成が行われ、Ｔ細胞受容体遺伝子再構成断片（T-cell receptor excision circles：以下、「ＴＲＥＣｓ」という）と呼ばれる環状ＤＮＡが産生される。また、正常なＢ細胞でもこれが新たに造られる場合の産生マーカーとして、Ｉｇκ鎖遺伝子再構成断片（Kappa-deleting recombination excision circles：以下、「ＫＲＥＣｓ」という）、と呼ばれる環状ＤＮＡが産生される。このため、ＴＲＥＣｓおよびＫＲＥＣｓをＰＣＲ（polymerase chain reaction）法で測定すればごく少量の血液からも測定が可能である（非特許文献２）したがって、血液ろ紙検体に含まれるＴＲＥＣｓおよびＫＲＥＣｓの量をＴおよびＢ細胞の正常成熟の指標として評価することで、ＳＣＩＤをスクリーニングすることができる。すなわち、ＴＲＥＣｓの存在はＴ細胞、ＫＲＥＣｓの存在はＢ細胞の成熟を意味するため、ＴＲＥＣｓおよびＫＲＥＣｓの減少はＳＣＩＤをスクリーニングする指標となる。近年、欧米を中心にＴＲＥＣを検出する定量ＰＣＲ法を用いた新生児スクリーニングが行われるようになり、その有用性が示されてきている。一方、日本のＳＣＩＤ患者の予後改善のためにも、広く新生児マススクリーニングが行われることが望まれているものの、現在のところ、希望者のみの拡大スクリーニング検査となっている。
【０００６】
脊髄性筋委縮症（ＳＭＡ）は、脊髄前角細胞の変性による運動ニューロン病であり筋緊張低下と進行性の筋力低下を示し、知的障害は呈さない。発症年齢と最高到達運動機能によりＩ型（生涯座位未獲得）、ＩＩ型（生涯立位未獲得）、ＩＩＩ型（歩行可能）、ＩＶ型（成人期発症）に分類される。小児期発症のＳＭＡでは９５％が５番染色体長腕５ｑ１３に存在するＳＭＮ１遺伝子変異による。臨床的なＳＭＡであっても、ＳＭＮ１遺伝子欠失を認めない症例、いわゆるｎｏｎ－５ｑＳＭＡが存在し、その頻度はＩＩＩ型、ＩＶ型で高くなる（非特許文献３）。我が国ではＩ型の重症例は、出生２万人に対して１人前後、乳児期～小児期に発症するＳＭＡの罹患率は１０万人に１～２人と言われている。近年、本国においてもＳＭＡに対する治療薬が承認され、早期診断、早期治療が重要視されてきている。新生児におけるＳＭＡのスクリーニング検査では、血液ろ紙検体に含まれるＳＭＮ１遺伝子を指標として評価することができる（非特許文献４：003-201804-kijyun.pdf (nanbyou.or.jp））。
【０００７】
乾燥血液ろ紙ディスク（dried blood spot；ＤＢＳ）を用いた定量ＰＣＲによるＳＣＩＤの測定方法としては、特許文献１（特許６７６１０９３、積水）、特許文献２（ＷＯ２０２１－０４９６０１、積水）、特許文献３（特開２０２２－０５３９６１、ＫＭバイオロジクス出願特許）がある。また、定量ＰＣＲによるＳＭＡの測定方法としては、特許文献４（ＷＯ２０２１－０２０１６１、積水）がある。これらの測定は対象疾患１つを個別に定量ＰＣＲで測定する方法であり、積水メディカルでは受託検査として、ＳＣＩＤ（ＴＲＥＣ／ＫＲＥＣ）とＳＭＡを個別に測定している。
しかしながら、拡大スクリーニングでは、対象とする疾患を同時に測定できた方が、早期診断だけでなく、受診者の費用面からもメリットがある。このため、ＳＣＩＤとＳＭＡを同時測定する検査キットが販売されている。パーキンエルマー社のＮｅｏＭＤｘキット（非特許文献５：ＮｅｏＭＤｘキット－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＪａｐａｎ）およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＴａｑＭａｎ
ＴＭ
ＳＣＩＤ／ＳＭＡＰｌｕｓＡｓｓａｙ（非特許文献６：ＴａｑＭａｎ
ＴＭ
ＳＣＩＤ／ＳＭＡＰｌｕｓＡｓｓａｙ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ））である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
特許６７６１０９３
ＷＯ２０２１－０４９６０１
特開２０２２－０５３９６１
ＷＯ２０２１－０２０１６１
特表２００５－５１４００５
【非特許文献】
【０００９】
金兼弘和，今井耕輔，森尾友宏：重症複合免疫不全症～その発見から今後の展望～．日本臨床免疫学会会誌．４０，１４５－１５４（２０１７）
ＣｈａｎＫ．，ＰｕｃｋＪ．Ｍ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒｓｅｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．１１５：３９１－３９８，２００５．
荒川玲子，日野香織、北村裕梨、斎藤加代子：神経筋疾患の遺伝学的検査．脳と発達．５０，１９２－１９６（２０１８）
難病情報センターウェブサイト：３脊髄性筋委縮症003-201804-kijyun.pdf(nanbyou.or.jp)
パーキンエルマー社：ＮｅｏＭＤｘキットＮｅｏＭＤｘキット－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＪａｐａｎ
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社：ＴａｑＭａｎ（ＴＭ）ＳＣＩＤ／ＳＭＡＰｌｕｓＡｓｓａｙＴａｑＭａｎ（ＴＭ）ＳＣＩＤ／ＳＭＡＰｌｕｓＡｓｓａｙ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣおよびＳＭＮ１遺伝子の量を同時に測定する方法が求められており、特異性・頑健性の点で特に優れた測定法を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
（【００１１】以降は省略されています）

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