発明の詳細な説明【技術分野】 【０００１】 本発明は、遊離脂肪酸生産藻類と、遊離脂肪酸生産藻類の製造方法、および、遊離脂肪酸生産藻類を用いた脂肪酸製造方法に関する。 続きを表示（約 3,900 文字）【背景技術】 【０００２】 化石燃料依存からの脱却を目指して、エネルギー物質の持続可能な生産技術の開発が世界中で進められている。その中で、細胞内にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等の脂質を蓄積することのできる藻類が注目されている。このような藻類の細胞内に蓄積した脂質は、ジェット燃料やバイオディーゼル燃料（ＢＤＦ：登録商標）の原料に用いることができるため、燃料生産に関する研究が行われている。しかしながら、これらの藻類は、細胞内にＴＡＧ等の脂質を蓄積するが、蓄積した脂質を取り出すには、培養した藻類菌体を回収・乾燥し、有機溶媒等で抽出する必要がある（細胞内生産法）。特に、藻類菌体の回収・乾燥及び有機溶媒による抽出工程は、燃料物質の生産に係る投与エネルギーの５０％以上を要するため、実用化の弊害となっている。 【０００３】 そのため、遺伝子組換え藻類を用いた遊離脂肪酸（Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ：以下、ＦＦＡともいう）の細胞外生産系が注目されている。 従来の細胞外生産系である遺伝子組換え藻類の脂肪酸代謝経路の模式図を図５に示す。 藻類は、光合成によって同化したＣＯ ２ からアシルＡＣＰを合成して膜脂質を生合成する。膜脂質からリパーゼの働きによりＦＦＡが切り出されるが、ＦＦＡはアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）によりアシルＡＣＰへと変換されて膜脂質の生合成に再利用されるため、通常は細胞外にＦＦＡは放出されない。しかし、アシルＡＣＰ合成酵素遺伝子（ａａｓ）を破壊すると、細胞内にＦＦＡが蓄積し過剰量のＦＦＡは細胞外へと放出される。さらに、外来のチオエステラーゼ遺伝子（ｔｅｓ）を導入することにより、直接、アシルＡＣＰからＦＦＡを切り出すことが可能となり、ＦＦＡ生産量が大きく増大する。 【０００４】 本発明者らは、非特許文献１において、シアノバクテリアの一種である、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２、以下、７９４２株ともいう）のＳＰｃ株由来で、遺伝子操作によって内在性のアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損したｄＡＳ１株、非特許文献２において、ｄＡＳ１株に大腸菌由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（｀t ｅｓＡ）を導入したＦＦＡ生産能に優れたｄＡＳ１Ｔ株を提案している。 非特許文献３において、７９４２株の硝酸イオン輸送体欠損株であるＮＡ３を親株として、アシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損と大腸菌由来のチオエステラーゼ（｀tｅｓ Ａ）を導入したｄＡＳ２Ｔ株に、ＦＦＡを細胞外に排出するためのｒｎｄＡ１Ｂ１を過剰発現するためのプラスミド（ｐＲＮＤ１）を導入した細胞外へのＦＦＡ放出能に優れたｄＡＳ２Ｔ／ｐＲＮＤ１株を提案している。 【０００５】 ＦＦＡを細胞外に放出する細胞外放出系により、細胞内生産法よりもエネルギー効率に優れたバイオ燃料製造が可能である。しかしながら、上記したように、細胞外放出系の遊離脂肪酸生産藻類は、別種由来の遺伝子（以下、外来遺伝子ともいう）が導入されている。 このような外来遺伝子を組み込んだ自然界には存在しない生物は、環境中に漏洩すると、生態系に悪影響を及ぼしかねない。そのため、外来遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え藻類による遊離脂肪酸の工業生産実用化のためには、遺伝子組換え藻類の漏洩を防ぐための設備や管理などが必要である。そのため、外来遺伝子を用いることなく、親株である藻類が生来備える内在性遺伝子を高発現させた、非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類を実現することが求められている。 【０００６】 ここで、ＦＦＡを高生産させるには光合成を盛んに行わせればよい。しかし、遊離脂肪酸生産藻類を含む藻類は強い光に弱く、強光条件下では、増殖、光合成が停止してしまう場合もある。 【先行技術文献】 【非特許文献】 【０００７】 Takatani N, Use K, Kato A, Ikeda K, Kojima K, Aichi M, et al.(2015) Essential role of acyl-ACP synthetase in acclimation of the cyanobacterium Synechococcus elongatus strain PCC 7942 to high-light conditions. Plant Cell Physiol. 56:1608-15. Kato A, Use K, Takatani N, Ikeda K, Matsuura M, Kojima K, Aichi M, et al. (2016) Modulation of the balance of fatty acid production and secretion is crucial for enhancement of growth and productivity of the engineered mutant of the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Biotechonol for Biofu. Vol. 9, 91 Kato A, Takatani N, Use K, Uesaka K, Ikeda K, Chang Y, et al. (2015)Identification of a cyanobacterial RND-type efflux system involved in export of free fatty acids. Plant Cell Physiol. 56:2467-77. Kato A, Takatani N, Ikeda K, Maeda SI, Omata T (2017) Removal of the product from the culture medium strongly enhances free fatty acid production by genetically engineered Synechococcus elongatus. Biotechnol Biofuels 10:141. 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【０００８】 本発明は、藻類が生来備える内在性遺伝子を高発現させた非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類と、この非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法と、非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類を親株として光合成機能を強化した遊離脂肪酸生産藻類と、遊離脂肪酸生産藻類を用いた遊離脂肪酸製造方法を提供することを課題とする。 【課題を解決するための手段】 【０００９】 本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。 １．藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、 別種由来の遺伝子を有さない非遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。 ２．シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）を親株とすることを特徴とする１．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。 ３．ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６３）であることを特徴とする１．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。 ４．藻類に、生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入することを特徴とする非遺伝子組換え型の遊離脂肪酸生産藻類の製造方法。 ５．藻類が生来備えるリパーゼをコードするＤＮＡ、生来備える遊離脂肪酸を細胞外に排出する輸送体をコードするＤＮＡからなる群から選ばれる１種以上を導入し、 さらに、ｋａｔＧ遺伝子およびｓｏｄＢ遺伝子を導入し、 遺伝子組換え型であることを特徴とする遊離脂肪酸生産藻類。 ６．ｄＡＳ１＿ｇ２１ｒ＿ＫＳ株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４８９）であることを特徴とする５．に記載の遊離脂肪酸生産藻類。 ７．１．～３．、５．～６．のいずれかに記載の遊離脂肪酸生産藻類を用いることを特徴とする脂肪酸の製造方法。 【発明の効果】 【００１０】 本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、別種由来の遺伝子（外来遺伝子）を有さない非遺伝子組換え型であるため、仮に環境中に漏洩したとしても、生態系へ悪影響を及ぼす可能性が低い。本発明の非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類は、藻類が生来備える遺伝子を高発現させたものであり、様々な藻類から製造することができる。脂肪酸製造を行う現場に生息する在来の藻類を親株として非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類を製造することにより、非遺伝子組換え型である遊離脂肪酸生産藻類が環境中に漏洩した際に生態系へ及ぼす影響を極めて小さくすることができる。 （【００１１】以降は省略されています） この特許をJ-PlatPatで参照する
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