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公開番号2024073457
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-05-29
出願番号2024024330,2022010240
出願日2024-02-21,2015-09-11
発明の名称増強された発光を産生するために赤外発光基質を活用するルシフェラーゼ配列
出願人プロメガコーポレイション,Promega Corporation
代理人個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/53 20060101AFI20240522BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】小動物光学イメージング用途において、通常の近赤外生物発光システム(450～620nm)が強く吸収される傾向にある深部組織からのシグナルの検出を可能にする、より長い波長及び低エネルギーを発する近赤外生物発光システムを提供する。
【解決手段】増強された発光及びより長い波長の近赤外シグナルを有する、改変型クリックビートルルシフェラーゼポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを本明細書に提供する。本開示は、前記改変型クリックビートルルシフェラーゼポリペプチド及び新規ルシフェリン誘導体を含む近赤外生物発光システム、ならびに前記改変型クリックビートルルシフェラーゼポリペプチド及び生物発光システムを使用する方法にも関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号１の位置４、１６、３４、４７、５１、５２、５５、７２、７３、７４、７９、８２、８３、８７、８９、１０４、１０９、１１３、１１７、１１９、１２４、１３０、１３１、１３３、１３６、１４４、１４６、１５６、１５９、１７０、１７９、１８６、２００、２１１、２１８、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３４、２４７、２５１、２５２、２５３、２５５、２８０、２８１、２８５、３０８、３０９、３１０、３１９、３２９、３３４、３３５、３３７、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５４、３５５、３５８、３６３、３７０、３７７、３９０、３９３、３９４、４００、４０１、４０９、４１２、４２０、４２２、４３１、４３７、４３９、４４４、４４５、４５３、４５５、４６７、４７１、４７３、４７９、４８４、４８９、４９６、５０１、５０３、５０８、５１６、５２８、５３１、５３５、５３７、５３９、またはそれらの組み合わせに対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光、変化した発光波長、変化した基質特異性、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを有することを特徴とする、単離ポリヌクレオチド。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置３５１、３８９、４５７、またはその組み合わせに対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＲ４Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ４７Ｅ、Ｓ５１Ｎ、Ｙ５２Ｃ、Ｆ５５Ｌ／Ｖ、Ｋ７２Ｅ、Ｉ７９Ｖ、Ｍ７３Ｋ／Ｔ、Ｎ７４Ｓ、Ｅ８２Ｇ、Ｎ８３Ｈ、Ｆ８７Ｓ、Ｉ８９Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｉ１０９Ｎ／Ｖ、Ｌ１１３Ｑ、Ｍ１１７Ｔ、Ｉ１１９Ｆ／Ｔ、Ｉ１２４Ｖ、Ｎ１３０Ｋ、Ｉ１３１Ｎ／Ｔ、Ｎ１３３Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、Ｆ１４４Ｌ、Ｋ１４６Ｅ、Ｎ１５６Ｄ、Ｎ１５６Ｋ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１７０Ｃ、Ｋ１７９Ｓ、Ｖ１８６Ａ、Ｇ２００Ｇ、Ｎ２１１Ｎ、Ｈ２１８Ｌ／Ｙ、Ｇ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｙ、Ｌ２２８Ｐ、Ｉ２２９Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２５１Ｓ、Ｇ２５１Ｉ、Ｙ２５２Ｃ、Ｖ２５５Ｄ／Ｆ、Ｅ２５３Ｋ、Ｒ２８０Ｓ、Ｓ２８１Ｎ／Ｑ、Ｖ２８５Ａ、Ｉ３０９Ｔ、Ｅ３１９Ｇ、Ｎ３２９Ｄ、Ｒ３３４Ｅ／Ｑ／Ｈ／Ｓ／Ｎ／Ｋ、Ｃ３３５Ｓ、Ｋ３３７Ｅ、Ｉ３４６Ｎ、Ｑ３４８Ｈ／Ｅ、Ｌ３５０Ｐ、Ｇ３５１Ｋ／Ｒ、Ｄ３５２Ｎ、Ｒ３５５Ｇ、Ｓ３５８Ｐ、Ｔ３６３Ａ／Ｓ、Ｉ３７０Ｔ、Ｉ３８９Ｆ／Ｇ／Ｓ／Ｖ、Ｉ３９０Ｉ、Ｍ３９３Ｋ／Ｌ、Ｖ３９４Ｍ、Ｎ４００Ｄ、Ｎ４０１Ｓ、Ｉ４０９Ｔ、Ｄ４１２Ｇ、Ｆ４２０Ｆ、Ｙ４２２Ｃ、Ｖ４３１Ａ、Ｅ４３７Ｇ、Ｉ４３９Ｖ、Ｓ４４４Ｃ／Ｒ／Ｔ、Ｑ４４５Ｈ、Ｅ４５３Ｋ、Ｖ４５５Ｄ、Ｋ４５７Ｎ、Ｄ４７１Ｖ、Ｅ４７３Ａ、Ｓ４７９Ｔ、Ｋ４８４Ｅ／Ｍ／Ｒ、Ｅ４８９Ｖ、Ｙ４９６Ｈ、Ｅ５０１Ｇ、Ｖ５０３Ｍ、Ｙ５０８Ｃ、Ｖ５１６Ａ、Ｔ５２８Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｑ５３５Ｈ、Ｌ５３７Ｗ、Ｋ５３９Ｒ、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つに対応する置換を含む、請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置３８９、４４４、及び２５１に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２または３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを含む、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置３３４及び３５１に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２または３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記アミノ酸置換が、Ｒ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒを含む、請求項６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置５１及び４４４に対応する位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記アミノ酸置換が、Ｓ５１Ｎ及びＳ４４４Ｒを含む、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸ポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年９月１１日に出願された、米国仮特許出願第６２／０４９，１５０号の優先権を主張する。
続きを表示（約 5,600 文字）【０００２】
本発明は、増強された発光を有し、より長い、近赤外波長シグナルを産生する、クリックビートル（ｃｌｉｃｋｂｅｅｔｌｅ）ルシフェラーゼ変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、前記クリックビートルルシフェラーゼ変異体ポリペプチド及び赤外発光基質を含む近赤外生物発光システムならびに前記クリックビートルルシフェラーゼ変異体ポリペプチド及び近赤外生物発光システムを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
長波長で低エネルギー放出型の生物発光は、多数の発光色を用いた多重化用途及び短波長が強く吸収されやすい深部組織イメージングの両方において大変注目されている。光学イメージングの標準的システムの多くは、生体試料を通る光の伝達が低下するため動物の全身を対象とした場合に有用性が限られる。光透過性は、血液中の特定の成分の吸収係数により制限される。ヘモグロビン（Ｈｂ）及び酸素結合型ヘモグロビン（ＨｂＯ
2
）による強い吸収で、血液及び動物組織を通る光の伝達及び透過深度が低下する。遠赤及び近赤外域（６８０～９００ｎｍ）において光を発する発光システムは、Ｈｂ及びＨｂＯ
2
の吸光スペクトルが最小であるため、最適なイメージングを可能とする。光透過性が最大となるこの領域は、全身動物の「光学窓」として知られる。生物発光レポーターシステムは、研究動物において広く使用されているが、組織透過性の低下の限界に依然として苦慮している。典型的な生物発光の放出光波長（４６０～６２０ｎｍ）は、限られた透過性深度を有する領域で生じる。全身動物における理想的な生物発光レポーターシステムにとって、６８０～９００ｎｍの領域における明るい放出光は、大変有益であるだろう。多くの生物発光システムが、可視光放出を赤方に偏移するように改変されている一方で、血液透過の重要な「光学窓」と大幅に重なる強い赤色放出を達成したものはない。
【０００４】
ｉｎｖｉｖｏでの分子イメージングのための以前の手法は、外部励起の不在下で生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）により発光する量子ドットコンジュゲートを含む。カルボキシレート提示量子ドットをウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼの生物発光タンパク質の突然変異体にカップリングすることにより調製されたこれらのコンジュゲートは、細胞にて及び動物にて、さらには深部組織にて長波長（赤から近赤外）の生物発光による光を発する。しかしながら、この手法は、レニラ属ルシフェラーゼに関するシグナル強度により及びセレンテラジン基質の相対的に低い水溶解度により制限される。別の手法、例えば、アカルミネ（Ｗａｋｏ）は、薄暗赤紫色（６７５ｎｍ）であるルシフェリン誘導体を活用する（図１９Ａ及び図１９Ｂを参照されたい）。
【０００５】
それゆえ、通常の近赤外生物発光システム（４５０～６２０ｎｍ）が強く吸収される傾向にある深部組織からのシグナルの検出を可能にするだろう、より長い波長及び低エネルギーを発する近赤外生物発光システムが、小動物光学イメージング用途において必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号１に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、少なくとも１つのアミノ酸置換を配列番号１の位置４、１６、３４、４７、５１、５２、５５、７２、７３、７４、７９、８２、８３、８７、８９、１０４、１０９、１１３、１１７、１１９、１２４、１３０、１３１、１３３、１３６、１４４、１４６、１５６、１５９、１７０、１７９、１８６、２００、２１１、２１８、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３４、２４７、２５１、２５２、２５３、２５５、２８０、２８１、２８５、３０８、３０９、３１０、３１９、３２９、３３４、３３５、３３７、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５４、３５５、３５８、３６３、３７０、３７７、３９０、３９３、３９４、４００、４０１、４０９、４１２、４２０、４２２、４３１、４３７、４３９、４４４、４４５、４５３、４５５、４６７、４７１、４７３、４７９、４８４、４８９、４９６、５０１、５０３、５０８、５１６、５２８、５３１、５３５、５３７、５３９、またはその組み合わせに対応する位置で含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光、放出光波長（発光波長）の変化、基質特異性の変化のうちの少なくとも１つ、またはその組み合わせを有する、前記単離されたポリヌクレオチドに関する。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、配列番号１の位置３５１、３８９、４５７、またはその組み合わせに対応する位置でさらに含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＲ４Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ４７Ｅ、Ｓ５１Ｎ、Ｙ５２Ｃ、Ｆ５５Ｌ／Ｖ、Ｋ７２Ｅ、Ｉ７９Ｖ、Ｍ７３Ｋ／Ｔ、Ｎ７４Ｓ、Ｅ８２Ｇ、Ｎ８３Ｈ、Ｆ８７Ｓ、Ｉ８９Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｉ１０９Ｎ／Ｖ、Ｌ１１３Ｑ、Ｍ１１７Ｔ、Ｉ１１９Ｆ／Ｔ、Ｉ１２４Ｖ、Ｎ１３０Ｋ、Ｉ１３１Ｎ／Ｔ、Ｎ１３３Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、Ｆ１４４Ｌ、Ｋ１４６Ｅ、Ｎ１５６Ｄ、Ｎ１５６Ｋ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１７０Ｃ、Ｋ１７９Ｓ、Ｖ１８６Ａ、Ｇ２００Ｇ、Ｎ２１１Ｎ、Ｈ２１８Ｌ／Ｙ、Ｇ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｙ、Ｌ２２８Ｐ、Ｉ２２９Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２５１Ｓ、Ｇ２５１Ｉ、Ｙ２５２Ｃ、Ｖ２５５Ｄ／Ｆ、Ｅ２５３Ｋ、Ｒ２８０Ｓ、Ｓ２８１Ｎ／Ｑ、Ｖ２８５Ａ、Ｉ３０９Ｔ、Ｅ３１９Ｇ、Ｎ３２９Ｄ、Ｒ３３４Ｅ／Ｑ／Ｈ／Ｓ／Ｎ／Ｋ、Ｃ３３５Ｓ、Ｋ３３７Ｅ、Ｉ３４６Ｎ、Ｑ３４８Ｈ／Ｅ、Ｌ３５０Ｐ、Ｇ３５１Ｋ／Ｒ、Ｄ３５２Ｎ、Ｒ３５５Ｇ、Ｓ３５８Ｐ、Ｔ３６３Ａ／Ｓ、Ｉ３７０Ｔ、Ｉ３８９Ｆ／Ｇ／Ｓ／Ｖ、Ｉ３９０Ｉ、Ｍ３９３Ｋ／Ｌ、Ｖ３９４Ｍ、Ｎ４００Ｄ、Ｎ４０１Ｓ、Ｉ４０９Ｔ、Ｄ４１２Ｇ、Ｆ４２０Ｆ、Ｙ４２２Ｃ、Ｖ４３１Ａ、Ｅ４３７Ｇ、Ｉ４３９Ｖ、Ｓ４４４Ｃ／Ｒ／Ｔ、Ｑ４４５Ｈ、Ｅ４５３Ｋ、Ｖ４５５Ｄ、Ｋ４５７Ｎ、Ｄ４７１Ｖ、Ｅ４７３Ａ、Ｓ４７９Ｔ、Ｋ４８４Ｅ／Ｍ／Ｒ、Ｅ４８９Ｖ、Ｙ４９６Ｈ、Ｅ５０１Ｇ、Ｖ５０３Ｍ、Ｙ５０８Ｃ、Ｖ５１６Ａ、Ｔ５２８Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｑ５３５Ｈ、Ｌ５３７Ｗ、Ｋ５３９Ｒ、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つに対応する置換を含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３８９、４４４、及び２５１に対応する位置で含んでよい。アミノ酸置換は、Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３３４及び３５１に対応する位置で含んでよい。アミノ酸置換は、Ｒ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置５１及び４４４に対応する位置でさらに含んでよい。アミノ酸置換は、Ｓ５１Ｎ及びＳ４４４Ｒを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸ポリペプチドを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、増強された発光を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が活用されるときに、増強された発光を有し得る。ルシフェリン誘導体は、
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2024073457000001.tif
39
162
を含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光は、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光は、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも４倍増加し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した放出光スペクトルを有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。ルシフェリン誘導体は、
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を含んでよい。ルシフェリン誘導体が、
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80
を含む場合、ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ～少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約６５０ｎｍ～約８００ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７２５ｎｍ～約７７５ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７５０ｎｍでスペクトル最大を有する光を発し得る。ルシフェリン誘導体が
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2024073457000004.jpg
33
77
を含む場合、ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ～少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大におけるシフトを有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約７５ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約６５０ｎｍ～約８００ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７００ｎｍ～約７７５ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７２５ｎｍでスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した基質特異性を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、ルシフェリン誘導体と比較して、ルシフェリンの存在下で該ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、異なるルシフェリン誘導体と比較して、あるルシフェリン誘導体の存在下で該ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有し得る。ルシフェリン誘導体は、
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39
162
を含んでよい。変異体ＣＢＲポリペプチドは、ルシフェラーゼ活性を有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．０１μＭ～少なくとも約５．００μＭのＰＢＩ－４８１３に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．５０μＭ～少なくとも約３．００μＭのＰＢＩ－４８１３に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．８２μＭまたは２．４１μＭのＰＢＩ－４８１３に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．０１μＭ～少なくとも約５．００μＭのＰＢＩ－４７３９に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約１．５０μＭ～少なくとも約４．５０μＭのＰＢＩ－４７３９に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約２．３３μＭまたは３．９５μＭのＰＢＩ－４７３９に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、ＰＢＩ－４８１３を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、ＰＢＩ－４７３９を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有し得る。配列は、コドン最適化されていてよい。配列は、配列番号６～９のポリヌクレオチドを含んでよい。ポリヌクレオチドは、ＣＢＲ変異体ポリペプチドに連結した目的のポリペプチドをさらにコードしてよく、該目的のポリペプチド及び該ＣＢＲ変異体ポリペプチドは融合タンパク質として発現することができる。目的のポリペプチドは、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を含んでよい。
【０００７】
本発明は、上記のポリヌクレオチド、またはその断片を含む、ベクターに関する。ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結し得る。
【０００８】
本発明は、上記のポリヌクレオチドまたは上記のベクターを含む細胞に関する。
【０００９】
本発明は、上記の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００１０】
本発明は、上記のポリヌクレオチドまたは上記のベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物に関する。
（【００１１】以降は省略されています）

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