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公開番号2024030078
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-03-07
出願番号2022132637
出願日2022-08-23
発明の名称生物膜中のレジオネラ属菌の可視化方法
出願人栗田工業株式会社
代理人個人,個人
主分類C12Q 1/6841 20180101AFI20240229BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】自家蛍光のある生物膜中のレジオネラ属菌を可視化する方法を提供する。
【解決手段】自家蛍光をもつ生物又は、生物膜中のレジオネラ属菌類を可視化する方法であって、in situ HCR法を適用する、レジオネラ属菌の可視化方法。前記可視化方法は、サンプルの濃縮、洗浄を行う工程、サンプルの固定を行う工程、イニシエーターDNAプローブのハイブリダイゼーションを行う工程、イニシエーターDNAプローブの洗浄を行う工程、伸長プローブの反応を行う工程、及び伸長プローブの洗浄を行う工程を有する。
【選択図】図1

特許請求の範囲【請求項１】
自家蛍光をもつ生物又は、生物膜中のレジオネラ属菌類を可視化する方法であって、ｉｎｓｉｔｕＨＣＲ法を適用する、レジオネラ属菌の可視化方法。
続きを表示（約 310 文字）【請求項２】
前記可視化方法は、
サンプルの濃縮、洗浄を行う工程、
前記サンプルの固定を行う工程、
イニシエーターＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを行う工程、
前記イニシエーターＤＮＡプローブの洗浄を行う工程、
伸長プローブの反応を行う工程、及び
前記伸長プローブの洗浄を行う工程
を有する請求項１のレジオネラ属菌の可視化方法。
【請求項３】
前記伸長プローブの洗浄液が界面活性剤を含む、請求項２のレジオネラ属菌の可視化方法。
【請求項４】
前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項３のレジオネラ属菌の可視化方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷却水系、環境水系、入浴水系、排水系、土壌、生体などの生物膜中に存在するレジオネラ属菌を可視化する方法に関する。
続きを表示（約 1,400 文字）【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌は生物膜中に存在し、細菌捕食性細胞中で増殖するといわれている。具体的にはアメーバやテトラヒメナ、人体ではマクロファージのなかでレジオネラ属菌が増殖した報告がある。
【０００３】
それらの細胞中のレジオネラ属菌を観察するために、レジオネラ属菌のみを可視化する方法としてFluorescence in situ hybridization法（以下ＦＩＳＨ法）が用いられている。この方法は、検出対象とする菌に特異的に反応するＤＮＡプローブを用い、このプローブに蛍光色素を結合させ、検出対象とする菌のみを蛍光色素で染色する方法である。
【０００４】
特許文献１には、ＤＮＡプローブを用いてレジオネラ属菌を検出する方法として、in situ hybridizationに言及している。しかし、特許文献１は飲料水、表層水中のレジオネラ属菌やL.pneumophila種の細菌を対象にしており、生物膜中のレジオネラ属菌を対象としていない。
【０００５】
特許文献２～４には、蛍光染色により目的細胞を観察するにあたって、夾雑する蛍光を異なる色に変異させる、蛍光染色した微生物を含む試料に、微生物の輪郭を染色する液を用いる方法が記載されている。特許文献２，４では、親油性スリチル色素を希釈した溶液を用いる。特許文献３では、親油性カルボシアニン色素または親油性ナイルレッドを希釈した溶液を用いる。なお、本発明では、これらの物質は使用しない。
【０００６】
特許文献５には、ＤＡＮプローブの蛍光を増幅させる方法として、in situ hybridization chain reaction法（ｉｎｓｉｔｕＨＣＲ法）が記載されている。しかし、特許文献５には、ｉｎｓｉｔｕＨＣＲ法をレジオネラ属菌に適用することは記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特表２００５－５１５７５６号公報
特開２０１１－４５３２９号公報
特開２０１１－１４７４０４号公報
特開２０１１－１７２５０９号公報
特表２０１９－５１８４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
レジオネラ属菌はレジオネラ症肺炎やポンティアック熱の原因菌であり、ミスト中に含まれたレジオネラ属菌が吸引されたり、水中のレジオネラが誤飲されたりして人体に侵入し、感染、発症に至る。ミストの発生源は冷却塔、シャワー水、加湿器、修景用水などが報告されている。
【０００９】
世界的にみて冷却水系は主要な感染源であり、冷却水系でのレジオネラの生態を明らかにすることは合理的なレジオネラ属菌防除を実施するために必須と考える。しかし、ＦＩＳＨ法によるレジオネラ属菌の実冷却水系での観察報告は、学術論文でも特許出願でも見出されていない。
【００１０】
この理由は、従来技術であるＦＩＳＨでは、自家蛍光を持つ生物内、生物膜内のレジオネラを蛍光観察することができないためと考えられる。冷却水系の生物膜は、藻、細菌、土砂、スケールなどからなり、このうち、藻、スケールには自家蛍光があり、ＦＩＳＨ法ではＤＮＡプローブの蛍光を検出することができない。
（【００１１】以降は省略されています）

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