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公開番号2025172879
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-26
出願番号2025142351,2024114751
出願日2025-08-28,2018-07-03
発明の名称糖タンパク質を作製するための細胞培養方法
出願人リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド,REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 1/00 20060101AFI20251118BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本出願は、所望量の成分、例えば、オルニチンまたはプトレシンについてダイズ加水分解産物のバッチをスクリーニングし、所望量のそのような成分を有する、ダイズ加水分解産物のバッチのみを選択するための方法を提供する。
【解決手段】本開示は、ダイズの選択されたバッチが補充された培地中で細胞を培養して、目的のタンパク質のより一貫した、高品質のロットを生成するための方法も説明する。さらに、本開示は、所望量のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物の別々のバッチが補充された培地中で細胞を培養することによって生成され、それによって、生成されたタンパク質の各バッチが、目的のタンパク質の品質または生成される高品質のタンパク質の量の向上を示す、複数のタンパク質調製物を提供する。
【選択図】図6A
特許請求の範囲【請求項１】
ダイズ加水分解産物を含む細胞培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養して、前記組換え異種糖タンパク質を生成することを含む方法であって、前記ダイズ加水分解産物が、≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、前記方法。
続きを表示（約 920 文字）【請求項２】
前記細胞の集団が、組換え異種糖タンパク質を発現する細胞のクローン性増殖によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ダイズ加水分解産物が０．００３％～０．０２７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地が≦５ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地が０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質がトラップ分子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記トラップ分子がエタネルセプト、リロナセプト及びアフリベルセプトからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記糖タンパク質がＡ１Ｎ－グリカン及び少なくとも１つの他のＮ－グリカン種を含み、Ａ１Ｎ－グリカンの相対量が前記糖タンパク質の全Ｎ－グリカン種の総量の≧１０％（ｗ／ｗ）である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ．グリコシル化タンパク質を発現する細胞を細胞培養培地中で培養して、前記糖タンパク質を生成すること、
ｂ．前記グリコシル化タンパク質を精製すること、
ｃ．前記精製したグリコシル化タンパク質をオリゴ糖フィンガープリント解析にかけること、
ｄ．前記糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、Ａ１Ｎ－グリカンの相対量を決定すること、及び
ｅ．前記糖タンパク質のＮ－グリカン種の総量と比較して、少なくとも１０％（ｗ／ｗ）のＡ１Ｎ－グリカンを提供するダイズ加水分解産物を選択すること
を含む方法。
【請求項１０】
前記選択されたダイズ加水分解産物が≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
配列表の組み込み
２０１８年２月１日に作成され、１１．２ＫＢのサイズの、「ＲＥＧＥ００９Ｐ０２ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前の提出されたテキストの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,200 文字）【０００２】
本発明は、細胞を培養するための方法及び組換えタンパク質を生成するための方法に関する。本発明は、特に、高品質の組換えタンパク質の一貫した生成を達成するためにダイズ加水分解産物含有培地において細胞を培養するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質加水分解産物、例えばダイズ加水分解産物を含有する細胞培養培地は、培養細胞からの組換えタンパク質の生成において一般に使用される。しかし、タンパク質加水分解産物は、細胞増殖または組換えタンパク質生成に悪影響を及ぼす化合物を含む可能性がある。これらの欠点にもかかわらず、タンパク質加水分解産物は、細胞培養の補充物として広く使用されている。
【０００４】
ヒトの生物的治療剤（バイオ医薬品）は、一般に、哺乳類細胞培養で生成される。しかし、生物的治療剤の品質及性能は、製造方法に非常に依存する。Ｔｅｂｂｅｙ，Ｐ．ａｎｄＤｅｃｌｅｒｃｋ，Ｐ．ＧｅｎｅｒｉｃｓａｎｄＢｉｏｓｉｍｉｌａｒｓＩｎｉｔｉａｔｉｖｅＪｏｕｒｎａｌ（２０１６）５：２，ｐｐ．７０－７３は、一貫したグリコシル化を有する生物学的薬物の製造のために、本明細書に組みこまれる。糖タンパク質の製造のための細胞培養方法に対する変更は、グリコシル化パターン、酸性種（例えば、シアル酸）の存在またはタンパク質上のグリカンの量を変動させる可能性がある（同上）。そのような変動は、生じるタンパク質生成においてタンパク質アイソフォームの不均一性を増大させ、これは、生物的治療剤の安定性、有効性または免疫原性を変化させ、最終的に、タンパク質のロットが拒否される可能性がある。
【０００５】
したがって、薬物製品の収量及び組成のロット間変動性を排除する細胞培養方法が非常に望ましい。本開示は、バッチ間で変動し、ダイズ加水分解産物を使用する培養において生成される高品質な糖タンパク質の組成及び収量を変化させる可能性がある、植物タンパク質加水分解産物（例えば、ダイズ加水分解産物）中のある種の成分を特定した。本開示は、数ある中でも、植物タンパク質加水分解産物のバッチをスクリーニングし、バイオ医薬品の生成で使用するための、植物タンパク質加水分解産物の望ましい濃度の成分を含むそうしたバッチを選択することによって、向上した細胞培養方法の必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ダイズ加水分解産物のバッチ中のオルニチンまたはプトレシンの濃度が、ダイズ加水分解産物を使用する細胞培養において生成されるタンパク質の品質及び組成に影響を及ぼすという発見に部分的に基づいている。本開示は、ある種の濃度のオルニチンまたはプトレシンを含むダイズ加水分解産物を含む培地中で培養された細胞が、ロット間でより一貫したグリコシル化パターン、グリカンの量及びシアル酸プロファイルを示す、より多くの量の高品質タンパク質を生成することも提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、組換え異種糖タンパク質を生成するために、ダイズ加水分解産物を含む細胞培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養する方法であって、ダイズ加水分解産物が、≦０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンまたはプトレシンを含む方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、方法は、ダイズ１グラム（ｇ）あたり≦０．６７ミリグラム（ｍｇ）未満のオルニチン（ｗ／ｗ）、または約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のオルニチンを含むダイズ加水分解産物を含む細胞培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養するステップを含む。一実施形態では、培養培地は、≦５ｍｇ／Ｌのオルニチン、または約０．６～３ｍｇ／Ｌのオルニチンを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組換え異種糖タンパク質を発現する細胞のクローン性増殖によって得られる。
【０００９】
一態様では、本発明は、糖タンパク質を生成するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ダイズ１グラム（ｇ）あたり≦０．６７ミリグラム（ｍｇ）未満のプトレシン（ｗ／ｗ）、または約０．００３％～０．０６７％（ｗ／ｗ）のプトレシンを含むダイズ加水分解産物を含む培養培地中で組換え異種糖タンパク質を発現する細胞の集団を培養するステップを含む。一実施形態では、培養培地は、≦５ｍｇ／Ｌのプトレシンまたは約０．６～３ｍｇ／Ｌのプトレシンを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、組換え異種糖タンパク質を発現する細胞のクローン性増殖によって得られる。
【００１０】
一実施形態では、糖タンパク質は、トラップ分子、例えば、リロナセプト（例えば、米国特許第６，９２７，００４号に開示される、ＩＬ１－トラップ）、アフリベルセプト（例えば、米国特許第７，０８７，４１１号に開示されるＶＥＧＦ－トラップ）、コンバセプト（ｃｏｎｂｅｒｃｅｐｔ）（例えば、米国特許第７，７５０，１３８号及び第８，２１６，５７５号に開示される、ＶＥＧＦ－トラップ）ならびにエタネルセプト（例えば、米国特許第５，６１０，２７９号に開示される、ＴＮＦ－トラップ）である。一実施形態では、糖タンパク質の全Ｎ－グリカン種の総量の≧１０％（ｗ／ｗ）は、Ａ１Ｎ－グリカンである。
（【００１１】以降は省略されています）

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