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公開番号2025146516
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-03
出願番号2024047341
出願日2024-03-22
発明の名称crRNA、タイプI CRISPR-Casシステム、標的DNAを編集する方法、標的DNAが編集された細胞を製造する方法、標的DNAを検出する方法、及びキット
出願人国立大学法人東京大学,国立大学法人東海国立大学機構
代理人弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
主分類C12N 15/11 20060101AFI20250926BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】タイプI CRISPR-Casシステムによって高効率でゲノム編集が可能であり、かつ、細胞内において安定性が高いcrRNAを提供すること。
【解決手段】標的DNA上のcrRNA認識配列を特異的に認識して結合する配列を含むスペーサー配列、及び
Cas5タンパク質及びCas6タンパク質からなる群より選択される少なくとも1種のCasタンパク質が切断可能なリピート配列
を含み、かつ、
環状である、
crRNA。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
標的ＤＮＡ上のｃｒＲＮＡ認識配列を特異的に認識して結合する配列を含むスペーサー配列、及び
Ｃａｓ５タンパク質及びＣａｓ６タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のＣａｓタンパク質が切断可能なリピート配列
を含み、かつ、
環状である、
ｃｒＲＮＡ。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
１つのスペーサー配列及び１つのリピート配列からなる、請求項１に記載のｃｒＲＮＡ。
【請求項３】
標的ＤＮＡを編集するためのタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、
次の（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質
（Ｂ）カスケードタンパク質
（Ｃ）請求項１に記載のｃｒＲＮＡ
を含む、システム。
【請求項４】
標的ＤＮＡを編集する方法であり、
請求項３に記載のタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡを編集する工程
を含む、方法。
【請求項５】
標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
請求項３に記載のタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを細胞内に導入又は細胞内で発現させて標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡを編集する工程
を含む、方法。
【請求項６】
前記細胞が真核細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であり、
請求項３に記載のタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを試料に接触させ、前記試料中の標的ＤＮＡを検出する工程
を含む、方法。
【請求項８】
請求項４～７のうちのいずれか一項に記載の方法に用いるためのキットであり、
次の（Ａ'）～（Ｃ'）：
（Ａ’）ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質、前記Ｃａｓタンパク質の発現ベクター、及び前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種、
（Ｂ’）カスケードタンパク質、前記カスケードタンパク質の発現ベクター、及び前記カスケードタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種、
（Ｃ’）請求項１に記載のｃｒＲＮＡ、前記ｃｒＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種、
を含み、
前記ｃｒＲＮＡの発現ベクターが、（ｉ）前記スペーサー配列及び前記リピート配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに、（ｉｉ）前記スペーサー配列をコードするポリヌクレオチドの挿入部位と、前記リピート配列をコードするポリヌクレオチドと、を含むベクターからなる群より選択される少なくとも１種である、
キット。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｃｒＲＮＡ、タイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、標的ＤＮＡを編集する方法、標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法、標的ＤＮＡを検出する方法、及びキットに関し、より詳しくは、新規の形態のｃｒＲＮＡ、これを含むタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、並びに、これらを用いて標的ＤＮＡを編集する方法、標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法、及び標的ＤＮＡを検出する方法、さらにはこれらの方法に用いるためのキットに関する。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集技術は、動物や植物の細胞の中でゲノムＤＮＡ配列を特異的に切断し、内在の修復機構を利用することで、任意の配列に自由に書き換える技術である。バイオサイエンス研究の分野だけでなく、農作物や畜産動物の品種改良や、再生医療や遺伝子治療の分野など、世界中でその利用が広がっている。
【０００３】
細菌や古細菌が持つＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、複数のタンパク質の複合体（カスケード）により標的領域を切断するクラス１と、１つのタンパク質により切断するクラス２とに分かれる。これまで、クラス２に分類されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムやＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）システム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３システムなどが、ゲノム編集ツールとして開発されてきている。特に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡ（標的ＤＮＡ上の標的領域付近の配列を特異的に認識して結合するｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡからなる）を含むシステムであるが、これらＣａｓ９タンパク質やガイドＲＮＡについての様々な検討がなされている。例えば、非特許文献１（ＬｉＬｉｕｅｔａｌ．，ＡＣＳＳｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０２３，１２，ｐ３５０－３５９）には、ガイドＲＮＡを環状にして、ｉｎｖｉｔｒｏや大腸菌内における安定性を向上させることが記載されている。
【０００４】
上記のシステムは全てクラス２に分類されるが、最近、クラス１に属するタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが、真核細胞のゲノム編集ツールとして利用できることが見出された（国際公開第２０１８／２２５８５８号（特許文献１））。このタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質（典型的にはＣａｓ３タンパク質、タイプＩ－ＤではＣａｓ１０タンパク質）と、複数のＣａｓタンパク質（カスケードタンパク質）から構成されるカスケードと、ｃｒＲＮＡとを含むシステムであり、ヒト培養細胞等の真核細胞内でも標的領域を特異的に切断し、該標的領域を含む数百～数ｋｂもの広範な領域の欠失変異を高効率で導入できることが判明している。また、上記のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと比較して、ｃｒＲＮＡが認識して結合する配列（ｃｒＲＮＡ認識配列）が長く特異性が高いことから、非特異的な切断が生じ難く安全性が高いと考えられている。
【０００５】
これまで、タイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた真核細胞内でのゲノム編集の手法では、両末端に完全長のリピート配列を残したｃｒＲＮＡ前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｒＲＮＡ）を用いることが必要であることが報告されている。かかるｃｒＲＮＡ前駆体が真核細胞内に導入されると、同細胞内でＣａｓタンパク質（Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質）によるプロセシングを受けて成熟型ｃｒＲＮＡ（ｍａｔｕｒｅｃｒＲＮＡ）となり、かかる成熟型ｃｒＲＮＡとカスケードタンパク質とが標的領域付近で複合体（カスケード複合体）を形成し、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質が前記標的領域を切断することで、ゲノム編集が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第２０１８／２２５８５８号
【非特許文献】
【０００７】
ＬｉＬｉｕｅｔａｌ．，ＡＣＳＳｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０２３，１２，ｐ３５０－３５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、近年その有用性が見出されたばかりであるタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの研究の進展は未だ十分とはいえず、さらなる高効率でのゲノム編集が求められている。また、タイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによる真核細胞内でのゲノム編集に必要な上記のｃｒＲＮＡ前駆体は、９０塩基程度の短いＲＮＡであることから、細胞内で分解されやすい。そのため、十分なゲノム編集効率を担保するためには大量のｃｒＲＮＡ前駆体を細胞内に導入する必要があるという課題も有していた。
【０００９】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、タイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって高効率でゲノム編集が可能であり、かつ、細胞内において安定性が高いｃｒＲＮＡ、これを含むタイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、並びに、これらを用いて標的ＤＮＡを編集する方法、標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法、及び標的ＤＮＡを検出する方法、さらにはこれらの方法に用いるためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、タイプＩＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに含まれるｃｒＲＮＡを環状化して新規の形態の環状ｃｒＲＮＡとすることで、従来の直鎖状のｃｒＲＮＡ前駆体（直鎖状ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）を用いた場合に比べて、有意に高い一本鎖ＤＮＡ切断活性を示し、優れたゲノム編集効率が達成されることを見出した。
（【００１１】以降は省略されています）

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