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公開番号2025090617
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-17
出願番号2025027249,2022567462
出願日2025-02-21,2021-05-06
発明の名称RUVCドメインを有する酵素
出願人メタゲノミ,インク.
代理人弁理士法人清原国際特許事務所
主分類C12N 15/09 20060101AFI20250610BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】際立ったドメインの特徴を有するエンドヌクレアーゼ酵素、並びにそのような酵素又はそのバリアントを用いる方法を提供する。
【解決手段】操作されたヌクレアーゼシステムであって、(a)特定の配列のいずれか1つに対して少なくとも75%の配列同一性を有する配列を含むエンドヌクレアーゼ、並びに(b)前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、(i)標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたリボ核酸配列、及び(ii)前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
操作されたヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号５７１８～５８４６又は配列番号６２５７のいずれか１つに対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含むエンドヌクレアーゼ、並びに
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたリボ核酸配列、及び
（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造
を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。
続きを表示（約 1,700 文字）【請求項２】
操作されたヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）配列番号５８４７～５８６１又は配列番号６２５８～６２７８を含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、前記エンドヌクレアーゼがクラス２タイプＩＩＣａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼ、並びに
（ｂ）前記エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたリボ核酸配列、及び
（ｉｉ）前記エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造
を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項３】
前記エンドヌクレアーゼが、未培養微生物に由来する、請求項１又は２に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項４】
前記エンドヌクレアーゼが、異なるＰＡＭ配列に結合するように操作されていない、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項５】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項６】
前記エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項７】
前記リボ核酸配列が、（ａ）配列番号５８８６～５８８７、５８９１、５８９３、若しくは５８９４のいずれか１つ、又は（ｂ）配列番号５８６２～５８８５、５８８８～５８９０、５８９２、５８９５～５８９６、若しくは６２７９～６３０１のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項８】
操作されたヌクレアーゼシステムであって、
（ａ）操作されたガイドリボ核酸構造であって、
（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたリボ核酸配列、及び
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたリボ核酸配列を含み、
ここで、前記リボ核酸配列が、（ａ）配列番号５８８６～５８８７、５８９１、５８９３、若しくは５８９４のいずれか１つ、又は（ｂ）配列番号５８６２～５８８５、５８８８～５８９０、５８９２、５８９５～５８９６又は６２７９～６３０１のいずれか１つの非縮重ヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造、並びに
（ｂ）前記操作されたガイドリボ核酸に結合するように構成されたクラス２タイプＩＩＣａｓエンドヌクレアーゼ
を含む、操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項９】
前記エンドヌクレアーゼが、配列番号５８４７～５８６１又は配列番号６２５８～６２７８を含む群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されている、請求項８に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
【請求項１０】
前記ガイドリボ核酸配列が、１５～２４ヌクレオチド長又は１９～２４ヌクレオチド長である、請求項８～９のいずれか一項に記載の操作されたヌクレアーゼシステム。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０２０年５月８日に出願された「ＥＮＺＹＭＥＳＷＩＴＨＲＵＶＣＤＯＭＡＩＮＳ」と題する米国仮出願第６３／０２２，３２０号、２０２０年５月２９日に出願された「ＥＮＺＹＭＥＳＷＩＴＨＲＵＶＣＤＯＭＡＩＮＳ」と題する米国仮出願第６３／０３２，４６４号、及び２０２０年１１月１９日に出願された「ＥＮＺＹＭＥＳＷＩＴＨＲＵＶＣＤＯＭＡＩＮＳ」と題する米国仮出願第６３／１１６，１５５号、及び２０２１年４月２７日に出願された「ＥＮＺＹＭＥＳＷＩＴＨＲＵＶＣＤＯＭＡＩＮＳ」と題する米国仮出願第６３／１８０，５７０号の優先権を主張し、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 3,200 文字）【背景技術】
【０００２】
Ｃａｓ酵素は、それらの関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ：ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）と共に、そのような微生物を、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡガイド核酸切断によって感染性ウイルス及びプラスミドなどの非自己核酸から保護するのに役立つ原核生物免疫システムの広範な（約４５％の細菌、約８４％の古細菌）構成成分であるようである。ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ要素をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）要素は、構造及び長さにおいて比較的保存され得るが、それらのＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：Ｃａｓ）タンパク質は極めて多様であり、多種多様な核酸相互作用ドメインを含有する。ＣＲＩＳＰＲＤＮＡ要素は１９８７年という早い時期に観察されてきたが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能力は比較的最近になって初めて認識され、多様なＤＮＡ操作及び遺伝子編集用途における組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用につながった。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年５月２９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は、５５９２１＿７１２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２４，６５９，４３９バイトである。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたヌクレアーゼシステムであって、（ａ）ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメイン及びＨＮＨドメインを含むエンドヌクレアーゼであって、当該エンドヌクレアーゼは未培養微生物に由来し、当該エンドヌクレアーゼはクラス２タイプＩＩＣａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼ、並びに（ｂ）エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインは、配列番号１８２７～３６３７のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【０００５】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたヌクレアーゼシステムであって、（ａ）配列番号１８２７～３６３７のいずれか１つに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性を有するＲｕｖＣ＿ＩＩＩドメインを含むエンドヌクレアーゼ、並びに（ｂ）エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。
【０００６】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたヌクレアーゼシステムであって、（ａ）配列番号５５１２～５５３７を含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ：ＰＡＭ）配列に結合するように構成されたエンドヌクレアーゼであって、当該エンドヌクレアーゼがクラス２タイプＩＩＣａｓエンドヌクレアーゼである、エンドヌクレアーゼ、並びに（ｂ）エンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成された操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造を含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、未培養微生物に由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、異なるＰＡＭ配列へと結合するようには操作されていない。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１４エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｄエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｅエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｂエンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ｃエンドヌクレアーゼ、又はＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼではない。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＨＮＨドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒリボ核酸配列は、配列番号５４７６～５５１１及び配列番号５５３８のいずれか１つから選択される約６０～９０個の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。
【０００８】
いくつかの態様では、本開示は、操作されたヌクレアーゼシステムであって、（ａ）操作されたガイドリボ核酸構造であって、（ｉ）標的デオキシリボ核酸配列にハイブリダイズするように構成されたガイドリボ核酸配列、及び（ｉｉ）エンドヌクレアーゼに結合するように構成されたｔｒａｃｒリボ核酸配列を含み、ここで、ｔｒａｃｒリボ核酸配列が、配列番号５４７６～５５１１及び配列番号５５３８のいずれか１つから選択された約６０～９０個の連続するヌクレオチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、ｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、操作されたガイドリボ核酸構造、並びに（ｂ）操作されたガイドリボ核酸に結合するように構成されたクラス２タイプＩＩＣａｓエンドヌクレアーゼを含む、操作されたヌクレアーゼシステムを提供する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、配列番号５５１２～５５３７を含む群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に結合するように構成されている。
【０００９】
いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、少なくとも２つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作されたガイドリボ核酸構造は、ガイドリボ核酸配列及びｔｒａｃｒリボ核酸配列を含む、１つのリボ核酸ポリヌクレオチドを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、原核生物、細菌、古細菌、真核生物、真菌、植物、哺乳動物、又はヒトのゲノム配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイドリボ核酸配列は、１５～２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのＮ末端又はＣ末端に近接した１つ以上の核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、配列番号５５９７～５６１２から選択される配列を含む。
（【００１１】以降は省略されています）

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