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公開番号2025089251
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-12
出願番号2024156745
出願日2024-09-10
発明の名称肝臓オルガノイドを増殖させるための培地
出願人国立大学法人東京大学,関東化学株式会社
代理人弁理士法人葛和国際特許事務所
主分類C12N 1/00 20060101AFI20250605BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明の課題は、従来培地に比べてコストの低い、肝臓オルガノイドを増殖するための新しい培地を提供することにある。
【解決手段】L細胞をR-spondin-1、肝細胞増殖因子(HGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)7および線維芽細胞増殖因子10を発現するように改変した改変L細胞の培養上清を含む、ヒト多能性幹細胞由来肝臓オルガノイドの増殖用培地によって上記課題は解決された。
【選択図】図5
特許請求の範囲【請求項１】
Ｌ細胞をＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）７および線維芽細胞増殖因子１０を発現するように改変した改変Ｌ細胞の培養上清を含む、肝臓オルガノイドの増殖用培地。
続きを表示（約 840 文字）【請求項２】
肝臓オルガノイドが、多能性幹細胞由来肝臓オルガノイドである、請求項１に記載の増殖用培地。
【請求項３】
多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項２に記載の増殖用培地。
【請求項４】
改変Ｌ細胞の培養上清が、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、ＨＧＦおよびＦＧＦ－７およびＦＧＦ－１０を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖用培地。
【請求項５】
改変Ｌ細胞の培養上清が、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、ＨＧＦ、ＦＧＦ－７およびＦＧＦ－１０を、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１：ＨＧＦ：ＦＧＦ－７：ＦＧＦ－１０＝３０：１：２：２の比率で含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖用培地。
【請求項６】
改変Ｌ細胞の培養上清が、改変Ｌ細胞を、ＦＢＳを含む培地で培養することにより得られたものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖用培地。
【請求項７】
改変Ｌ細胞が、Ｌ細胞に、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、ＨＧＦ、ＦＧＦ－７およびＦＧＦ－１０の遺伝子配列を夫々含む４種類のレンチウイルスベクターを順次感染させることによって作製されたＬ－ＲＨＦ２細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖用培地。
【請求項８】
改変Ｌ細胞が、ＮＩＴＥＰ－０４１１１（受託番号）で表されるＬ－ＲＨＦ２細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖用培地。
【請求項９】
ヒト多能性幹細胞由来肝臓オルガノイドを増殖する方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖用培地中でヒト多能性幹細胞由来肝臓オルガノイドを培養することを含む、前記方法。
【請求項１０】
増殖した肝臓オルガノイドの幹細胞性を高める方法であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の増殖用培地で肝臓オルガノイドを増殖させることを含む、前記方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓オルガノイドを増殖させるための培地、肝臓オルガノイドの増殖方法、かかる方法により作製した増殖した肝臓オルガノイド等に関する。
続きを表示（約 2,400 文字）【背景技術】
【０００２】
オルガノイドと呼ばれる細胞凝集体は、その構造や機能が生体組織と類似していることから、医薬品や食品の生体への影響を調べるためのツールとして利用されている。そのため、オルガノイドを形成、増殖するための様々な方法や、それらの方法に用いられる培地の開発が進められている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ｉ．任意選択で、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、５０～５００ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ｉｉ．Ｒ－スポンジン及び少なくとも１つのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む、Ｗｎｔアゴニスト、ｉｉｉ．５～１００ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ｉｖ．５～１００ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ならびにｖ．アクチビン受容体様キナーゼＡＬＫ４、ＡＬＫ５及び／またはＡＬＫ７シグナル伝達経路の阻害剤を含む、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）阻害剤を含む肝細胞培養培地が開示されており、かかる培養培地により培養された肝臓組織から単離された細胞の少なくとも一部が肝細胞オルガノイドを形成すること、同培養培地が肝細胞オルガノイドを増殖することにも用いられることが開示されている。
【０００４】
また、特許文献２には、Ｒスポンジン１～４のいずれか１つ、ノギン、ニコチンアミド、ＥＧＦ、ＦＧＦ１０、ＨＧＦ、ガストリン、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＧＥ２を含む肝臓細胞の増殖のための培地が開示されており、かかる培地を用いて、肝臓の細胞または組織断片から肝臓オルガノイドを形成することが開示されている。特許文献３には、ニューレグリンポリペプチドなどのＥｒｂ３／４リガンド、ＦＧＦ－７および／または１０などの受容体型チロシンキナーゼリガンド、およびＮｏｇｇｉｎなどのＢＭＰ阻害剤、さらにはＲスポンジンなどのＷｎｔアゴニストを含む培地が開示されており、かかる培地を用いて上皮幹細胞を増殖させ、肺オルガノイド、乳房オルガノイドを形成することが開示されている。
しかしながら、いずれの文献に記載のオルガノイドを形成、増殖させるための培地においても、増殖因子等の高価なリコンビナントタンパク質が多数使用されており、そのため、培地の価格が高くなり、ユーザーの経済的負担が大きくなっている。
【０００５】
このようなリコンビナントタンパク質を使用しない例として、マウスＬ細胞にＷｎｔ３ａ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１およびＮｏｇｇｉｎを発現するように遺伝子導入した細胞の培養上清を用いて調製した培地で、ヒト人工多能性幹細胞由来の小腸オルガノイドを培養した例が報告されている（非特許文献１）。
しかしながら、肝臓オルガノイドは、オルガノイドの代表的な１つでありながら、培養系、機能評価、遺伝子導入などの肝臓オルガノイドを扱うための体系的な方法論が不十分であり、肝臓オルガノイドにおいて、リコンビナントタンパク質を用いることなく培養された例はいまだ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特表２０２２－５１１７５７号公報
特表２０１４－５１６５６２号公報
特開２０２２－２８８２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
Takahashi et al., Stem Cell Reports. 2018 Jan 9; 10(1): 314-328
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、従来培地に比べてコストの低い、肝臓オルガノイドを増殖するための新たな培地等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究する中で、マウス皮膚線維芽細胞株Ｌ細胞をＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を発現するように改変した、Ｌ－ＲＨＦ２細胞を樹立することに成功した。そして本発明者らは、Ｌ－ＲＨＦ２細胞の培養上清を用いることで、従来の肝臓オルガノイドの培養培地に用いるような高価なリコンビナントタンパク質を用いる必要がなく、低コストで肝臓オルガノイドを増殖させることができる培地を調製できるという知見を得た。かかる知見に基づき、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］Ｌ細胞をＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）７および線維芽細胞増殖因子１０を発現するように改変した改変Ｌ細胞の培養上清を含む、肝臓オルガノイドの増殖用培地。
［２］肝臓オルガノイドが、多能性幹細胞由来肝臓オルガノイドである、前記［１］に記載の増殖用培地。
［３］多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、前記［２］に記載の増殖用培地。
［４］改変Ｌ細胞の培養上清が、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、ＨＧＦおよびＦＧＦ－７およびＦＧＦ－１０を含む、前記［１］～［３］のいずれか１つに記載の増殖用培地。
［５］改変Ｌ細胞の培養上清が、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、ＨＧＦ、ＦＧＦ－７およびＦＧＦ－１０を、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１：ＨＧＦ：ＦＧＦ－７：ＦＧＦ－１０＝３０：１：２：２の比率で含む、前記［１］～［４］のいずれか１つに記載の増殖用培地。
［６］改変Ｌ細胞の培養上清が、改変Ｌ細胞を、ＦＢＳを含む培地で培養することにより得られたものである、前記［１］～［５］のいずれか１つに記載の増殖用培地。
（【００１１】以降は省略されています）

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