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公開番号2025084743
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-06-03
出願番号2025014842,2022105795
出願日2025-01-31,2017-07-19
発明の名称CPF1に基づくゲノム編集の治療適用
出願人デュークユニバーシティ
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/12 20060101AFI20250527BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】CRISPR/Cpf1に基づくゲノム編集の治療適用を提供すること。
【解決手段】ジストロフィン遺伝子を標的とし、特定の配列に対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むCpf1ガイドRNA(gRNA)が提供される。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ジストロフィン遺伝子を標的とし、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
続きを表示（約 2,200 文字）【請求項２】
Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、請求項１に記載の少なくとも１種のＣｐｆ１ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項３】
第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡと第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物であって、前記第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡは各々が、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、ここで、前記第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡは、異なるポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡが、ジストロフィン遺伝子を標的とする、ＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項４】
前記第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡが、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６に対応するポリヌクレオチド配列を含み、且つ前記第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡが、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６１に対応するポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項５】
前記第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡが、以下：
（ｉ）配列番号５４に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡ、および配列番号６２に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡ；
（ｉｉ）配列番号５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡ、および配列番号６３に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡ；ならびに
（ｉｉｉ）配列番号５６に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡ、および配列番号６１に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡ
からなる群から選択される、請求項３または４に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項６】
Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項３～５のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項７】
前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、請求項２または６に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項８】
前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテーラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７１、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア・バクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユウバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｄｉｓｉｅｎｓ）およびポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｍａｃａｃａｅ）からなる群から選択される細菌種に由来する、請求項７に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項９】
前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＡｓＣｐｆ１）に由来する、請求項６～８のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
【請求項１０】
前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、配列番号１２４または配列番号１２５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項６～９のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１６年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３６３，８８８号明細書からの優先権を主張する。
続きを表示（約 2,100 文字）【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。上述のＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年７月１９日に作成され、０２８１９３－９２５０－ＷＯ００配列表．ｔｘｔと称し、サイズは４６，０５６バイトである。
【０００３】
政府の権利の陳述
本発明は、ＮＩＨおよびＡｒｍｙ／ＭＲＭＣによりそれぞれ授与された連邦政府補助金（ＦｅｄｅｒａｌＧｒａｎｔ）番号：ＡＲ０６９０８５およびＭＤ１４００７１の下で政府の支援を受けて行なわれた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【０００４】
本開示は、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１）由来のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）に基づくシステムおよびウイルス送達システムを使用する遺伝子発現の改変、遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ヒト細胞のゲノム修飾のために改変されており、そうしたものとして、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムがある。多種の微生物が、ＤＮＡ編集またはＲＮＡ編集システムを有することが明らかにされている。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９は、ゲノムＤＮＡにより平滑末端二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、これは、修復部位に小さな挿入および欠失（インデル）を残す非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはテンプレートの存在下の相同組換え修復によって修復される。これらのインデルを用いて、遺伝子をノックアウトする、スプライスアクセプターを除去する、または遺伝子調節エレメントを切断することができる。
【０００６】
遺伝する遺伝性疾患は、米国において子供に破壊的な影響を及ぼす。これらの疾患は現在、治療法がなく、症状を緩和する試みによってのみ管理され得る。数十年にわたり、遺伝子治療の分野では、この疾患の治療法が約束されている。しかしながら、治療用遺伝子の細胞および患者への安全且つ効率的な送達に関する技術的な障害により、このアプローチは制限されている。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、機能するジストロフィンの喪失に起因して、筋肉疲労、歩行の喪失および典型的には生後３０年での死亡を臨床的な特徴とする致命的な遺伝性疾患である。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中での遺伝的なまたは自発的な変異な結果である。ＤＭＤを引き起こすほとんどの変異はエクソンの欠失の結果であり、翻訳読み枠を枠外に押し出す。
【０００７】
ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節に関与するタンパク質複合体の重要な構成要素である。ＤＭＤ患者は概して、小児期には自身を身体的に支える能力を失い、十代にはますます弱まり、二十代には死亡する。ＤＭＤのための現在の実験的遺伝子治療戦略は、一過性の遺伝子送達媒体の反復投与を必要とする、または外来遺伝子物質のゲノムＤＮＡへの永続的な組込みに依存する。これらの方法は両方とも、安全性に深刻な懸念を有する。さらに、これらの戦略は、大きく且つ複雑なジストロフィン遺伝子配列を送達することができないことにより制限されている。ジストロフィン遺伝子中に変異を有する患者を直すまたは処置するための、より正確で効率的な遺伝子編集ツールが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ジストロフィン遺伝子を標的とし、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を対象とする。
【０００９】
本発明は、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、少なくとも１つの本明細書に記載のＣｐｆ１ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物を対象とする。
【００１０】
本発明は、第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡと第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物を対象とし、第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡは各々、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、ここで、第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡは、異なるポリヌクレオチド配列を含み、第１のＣｐｆ１ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子を標的とする。
（【００１１】以降は省略されています）

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