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公開番号2025072503
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-05-09
出願番号2025017268,2023088480
出願日2025-02-05,2014-11-26
発明の名称ポリヌクレオチド配列決定のための組成物及び方法
出願人イルミナインコーポレイテッド
代理人個人
主分類C12Q 1/6869 20180101AFI20250430BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】Hel308ヘリカーゼによる標的ポリヌクレオチドを特徴決定する方法及び組成物を提供する。
【解決手段】標的ポリヌクレオチドを特徴決定する方法であって:(a)Hel308ヘリカーゼ及び標的ポリヌクレオチドと接触している細孔を横切るポテンシャルの差を印加する工程;(b)細孔を通って移動する該標的ポリヌクレオチドの1ヌクレオチドにつき2つの異なる大きさのシグナルを測定する工程;並びに(c)(b)において測定された、該1ヌクレオチドにつき2つの異なる大きさのシグナルを使用して該標的ポリヌクレオチドを特徴決定する工程:を含み、該標的ポリヌクレオチドの特徴決定が、該標的ポリヌクレオチドの配列、該標的ポリヌクレオチドの長さ、該標的ポリヌクレオチドの同一性、及び該標的ポリヌクレオチドの給源の1以上を同定することを含む方法を提供する。
【選択図】図1C
特許請求の範囲【請求項１】
標的ポリヌクレオチドを特徴決定する方法であって：
(a) Hel308ヘリカーゼ及び該標的ポリヌクレオチドと接触している細孔を横切るポテ
ンシャルの差を印加する工程；
(b) 該Hel308ヘリカーゼの完全転位サイクルの間に該細孔を通って移動する該標的ポ
リヌクレオチドの1ヌクレオチドにつき2つの異なる大きさのシグナルを測定する工程であ
って、該2つのシグナルは、2つのフラクショナル転位工程により生成され、各フラクショ
ナル転位工程は、該細孔を通る該ポリヌクレオチドの部分的転位である、前記測定する工
程；並びに
(c) b)において測定された、該1ヌクレオチドにつき2つの異なる大きさのシグナルを
使用して該標的ポリヌクレオチドを特徴決定する工程：を含み、
該標的ポリヌクレオチドの特徴決定が、該標的ポリヌクレオチドの配列、該標的ポリヌ
クレオチドの長さ、該標的ポリヌクレオチドの同一性、及び該標的ポリヌクレオチドの給
源の1以上を同定することを含む、前記方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドの特徴決定が、該標的ポリヌクレオチドの配列を同定するこ
とを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、前記工程(a)－(c)を1回以上反復することを更に含む、請求項1記載の方法
。
【請求項４】
細孔を通じた標的ポリヌクレオチドのフラクショナル転位工程を調節する方法であって
：
(a)Hel308ヘリカーゼ及び該標的ポリヌクレオチドと接触している細孔を横切るポテン
シャルの差を印加する工程；
(b)該Hel308ヘリカーゼをHel308ヘリカーゼ基質の参照濃度とは異なる濃度の該基質と
接触させる工程であって、該基質濃度が、該参照濃度と比べた該基質濃度の差異に比例し
てフラクショナル転位工程の持続期間に変化を生じる工程；並びに
(c)該標的ポリヌクレオチドの1ヌクレオチドにつき2つの異なる大きさのシグナルを測
定する工程であって、該2つのシグナルは、該細孔を通る該標的ポリヌクレオチドの各ヌ
クレオチドの該Hel308ヘリカーゼによる2つ以上のフラクショナル転位工程により生成さ
れ、フラクショナル転位工程は、該細孔を通るヌクレオチドの部分的転位である、前記測
定する工程：を含む、前記方法。
【請求項５】
前記標的ポリヌクレオチドの転位が、該細孔を通じて転位するポリヌクレオチド上のポ
テンシャルの差により印加された加力の反対方向である、請求項1又は4記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリヌクレオチドの転位が、該細孔を通じて転位するポリヌクレオチド上のポ
テンシャルの差により印加された加力の方向である、請求項1又は4記載の方法。
【請求項７】
前記シグナルが電気的シグナルである、請求項1又は4記載の方法。
【請求項８】
前記電気的シグナルが、電流、電圧、トンネル電流、抵抗、ポテンシャル、電圧、コン
ダクタンス、及び横方向電気的測定値から選択された測定値である、請求項7記載の方法
。
【請求項９】
前記標的ポリヌクレオチドの1以上のヌクレオチド残基が、完全転位サイクルから得ら
れた単独の電気的シグナルを使用する1以上のヌクレオチドの特徴決定と比べ50％より大
きい精度で、完全転位サイクルの2つのフラクショナル工程から得られた電気的シグナル
を用いて特徴決定される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記細孔が、生物学的細孔である、請求項1又は4記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、2013年11月26日に出願され、「ポリヌクレオチド配列決定のための組成物及
び方法」と題する、米国特許仮出願第61/909,316号の優先権を主張するものであり、この
仮出願の全内容が引用により本明細書中に組み込まれている。
続きを表示（約 2,100 文字）【０００２】
（配列表）
本出願は、ASCIIフォーマットで電子提出され、且つその全体が引用により本明細書中
に組み込まれている配列表を含む。2014年11月25日に作製された該ASCIIコピーは、12957
-139-228_SL.txtと名前をつけ、且つサイズは19,778バイトである。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
本開示は概して、標的ポリヌクレオチドの配列を特徴決定することを含む、標的ポリヌ
クレオチドを特徴決定するための方法及び組成物に関する。
【０００４】
ポリヌクレオチド(例えば、DNA又はRNA)にコードされた情報は、医薬品及び生命科学に
最も重要であるので、迅速且つ安価にポリヌクレオチドを配列決定する必要性が存在して
いる。現在、市販の配列決定技術は、試料及びライブラリーの調製を必要とし、これらは
両方共骨が折れる。更に読み出しは、多くの適用に関して望ましいものよりもより遅い。
そのために、処理量は限定され且つ費用は相対的に高い。ナノポア配列決定は、標的ポリ
ヌクレオチドを迅速且つ安価に配列決定するように開発されたひとつの新規方法を表して
いる。
【０００５】
ナノポア配列決定は、イオン電流のためのチャネルを提供することができるナノポアを
利用する。ポリヌクレオチドは、ナノポアを通って電気泳動的に駆動され、且つポリヌク
レオチドはこのナノポアを通過する際に、ナノポアを通る電流(electrical current)を減
少する。各々の通過するヌクレオチド、又は一連のヌクレオチドは、特徴的電流を生じ、
且つこの電流レベルの記録は、そのポリヌクレオチドの配列に対応している。一部の電流
レベルは、複数のヌクレオチド(一般に3～4個)により支配されるので、精度を向上するた
めに当該技術分野の状態を改善する必要性が依然残っている。形状及び持続期間などのナ
ノポアを通じたポリヌクレオチド転位(translocate)として得られる電流レベルに関する
追加情報は、利点を提供することができる。
【０００６】
ナノポア配列決定の一般的挑戦は、ナノポアを通じたポリヌクレオチドの転位は、非常
に迅速であるので、個々のヌクレオチドの電流レベルは、解明されるには余りにも短いこ
とである。ナノポア配列決定の一つのアプローチは、電位に対する、ヘリカーゼ、トラン
スロカーゼ、又はポリメラーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質の誘導下での、ナ
ノポアを通じたポリヌクレオチドの制御された転位に関する。この制御された転位にもか
かわらず、数多くの配列決定誤差モードが、依然存在し、且つ配列決定の精度不良の一因
となっている。
【０００７】
従ってナノポアを通じたポリヌクレオチドの更に制御された転位及びヌクレオチド識別
におけるヌクレオチド転位のより良い解像を提供する方法及び組成物の必要性が存在する
。本開示は、この必要性を満たし、且つ関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
（実施態様の概要）
標的ポリヌクレオチドを特徴決定する方法が提供される。本方法は：(a)Hel308ヘリカ
ーゼ及び標的ポリヌクレオチドと接触している細孔を横切るポテンシャルの差を印加する
工程；(b)この細孔を通じた標的ポリヌクレオチドの1以上のフラクショナル転位(fractio
nal translocation)工程により発生された1以上のシグナルを測定する工程；並びに、(c)
このフラクショナル転位工程の電気的シグナルからこの標的ポリヌクレオチドを特徴決定
する工程：を含む。標的ポリヌクレオチドの特徴決定は、(1)標的ポリヌクレオチドの配
列；(2)標的ポリヌクレオチドの修飾；(3)標的ポリヌクレオチドの長さ；(4)標的ポリヌ
クレオチドの同一性；(5)標的ポリヌクレオチドの給源、又は、(6)標的ポリヌクレオチド
の二次構造：の1以上を同定することを含む。細孔を通じた標的ポリヌクレオチドのフラ
クショナル転位工程を調節する方法、並びに1mM未満のATP溶液又はヌクレオチド類縁体溶
液中に含有された細孔、Hel308ヘリカーゼ及び標的ポリヌクレオチドを含む、標的ポリヌ
クレオチドを特徴決定するための組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
（図面の簡単な説明）
図1Aは、ヘリカーゼによるポリヌクレオチドの転位に関する静電気的コマ送り(inchworm)モデルを示している。
【００１０】
図1Bは、一部の実施態様に従う、Hel308ヘリカーゼと接触している細孔を含む第一の例証的組成物を概略的に図示している。
（【００１１】以降は省略されています）

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