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公開番号2025069248
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-30
出願番号2025011852,2024519682
出願日2025-01-28,2022-09-29
発明の名称温度で選択可能なFRETカセットシグナル伝達
出願人ジェン-プローブ・インコーポレーテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/68 20180101AFI20250422BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】温度依存性様式で複数の特異的核酸配列または一塩基多型の存在を検出する方法を提供する。
【解決手段】侵襲性オリゴヌクレオチド及び一次プローブオリゴ(5’フラップオリゴヌクレオチド)が標的鎖核酸にハイブリダイズして、FEN-1エンドヌクレアーゼによって切断可能な侵襲的切断構造を形成して、切断された5’フラップ(一次切断フラップ)を放出し、二次反応では、一次反応からの一次切断フラップが、蛍光色素およびクエンチャー分子で標識されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるFRETカセット1にハイブリダイズして、フルオロフォアとクエンチャーとの間の部位でFEN-1エンドヌクレアーゼによって切断可能な第2の侵襲的切断構造を形成する。FRETカセット1の切断は、クエンチャーをフルオロフォアから分離し、フルオロフォアからの蛍光シグナルを検出することができる方法を提供する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
反応混合物中の２つの異なるＦＲＥＴカセットのどちらが切断されて蛍光シグナルを生成したかを決定する方法であって、前記方法は、
（ａ）切断が起こった場合、第１のＦＲＥＴカセットおよび第２のＦＲＥＴカセットの一方または両方を切断して２つの異なる蛍光切断産物を産生するために、前記反応混合物中で多重侵襲的切断反応を実施する工程であって、
前記第１のＦＲＥＴカセットが、フルオロフォアが付着した第１の５’フラップ部を含み、前記フルオロフォアの付着は、前記多重侵襲的切断反応におけるＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼによる前記第１のＦＲＥＴカセットの切断が、前記フルオロフォアを含む第１のカセット切断フラップを産生するように配置され、
前記反応混合物が、前記第１のカセット切断フラップに安定にハイブリダイズして、第１のＴｍより低い温度で第１の二重鎖を形成するが、前記第１のＴｍより高い温度では形成しない第１のマスキングオリゴヌクレオチドを含み、前記第１の二重鎖の前記第１のカセット切断フラップの前記フルオロフォアからの蛍光発光が消光され、
前記多重侵襲的切断反応で産生された前記２つの異なる蛍光切断産物の各々が、前記反応混合物中の異なる温度依存性蛍光消光プロファイルを特徴とする、工程と、
（ｂ）前記多重侵襲的切断反応の前記異なる蛍光切断産物によって産生された蛍光を示差的に消光する温度条件下で、蛍光モニタリング装置の単一チャネルを使用して、前記反応混合物中で産生された蛍光シグナルを測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果から、前記異なるＦＲＥＴカセットのどれが前記多重侵襲的切断反応において切断されたかを決定する工程と
を含む、方法。
続きを表示（約 1,600 文字）【請求項２】
工程（ａ）における前記第２のＦＲＥＴカセットが、切断された場合、蛍光消光をもたらす前記反応混合物中のいかなるマスキングオリゴにもハイブリダイズしない蛍光切断産物を産生する、請求項
１
に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）が、前記第１のＴｍより低い温度および前記第１のＴｍより高い温度で測定された蛍光シグナルを比較することを含む、請求項
２
に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）が、測定された蛍光シグナル間の差を計算することによって蛍光シグナルを比較することを含む、請求項
３
に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、前記第１のＴｍより低い温度で前記蛍光シグナルのいずれかを測定することを含み、前記第１の二重鎖の前記第１のカセット切断フラップの前記フルオロフォアからの蛍光発光が消光され、
工程（ｃ）が、測定可能な蛍光が工程（ｂ）で検出された場合、前記反応混合物中で前記第２のＦＲＥＴカセットが切断されたと決定することを含む、
請求項
２
に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）が、前記第１のＴｍより低い温度および前記第１のＴｍより高い温度の各々で前記蛍光シグナルのいずれかを測定することを含み、
工程（ｃ）が、前記第１のＴｍより高い温度で測定された前記蛍光シグナルが、前記第１のＴｍより低い温度で測定された前記蛍光シグナルより大きい場合、前記反応混合物中で前記第１のＦＲＥＴカセットが切断されたと決定することを含む、請求項
２
に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）が、融解／アニーリング曲線を生成するために、温度の関数として前記反応混合物中で産生された前記蛍光シグナルのいずれかを測定することを含む、請求項
１～６
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）が、前記融解／アニーリング曲線の導関数を計算することと、次いで、計算された前記導関数から、前記反応混合物が、前記第１のＦＲＥＴカセットが前記反応混合物中で切断されたことの指標としての前記第１のＴｍを特徴とする前記第１の二重鎖を含むかどうかを決定することとを含む、請求項
７
に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のＦＲＥＴカセットが、フルオロフォアが付着した第２の５’フラップ配列を含み、前記フルオロフォアの付着は、前記多重侵襲的切断反応における前記ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼによる前記第２のＦＲＥＴカセットの切断が、前記フルオロフォアを含む第２のカセット切断フラップを産生するように配置され、
前記反応混合物が、第２のＴｍより低い温度で第２の二重鎖を形成するために前記第２のカセット切断フラップにハイブリダイズするが、前記第２のＴｍより高い温度ではハイブリダイズしない第２のマスキングオリゴを含み、前記第２の二重鎖の前記第２のカセット切断フラップの前記フルオロフォアからの蛍光発光が消光され、
前記第１のＴｍと前記第２のＴｍとが、少なくとも５℃異なる、請求項
１
に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のＴｍが、前記第２のＴｍよりも大きく、
工程（ｂ）が、前記第２のＴｍより低い温度および前記第１のＴｍより高い温度で前記蛍光シグナルのいずれかを測定することを含み、
前記工程（ｃ）が、前記第１のＴｍより高い温度で測定された前記蛍光シグナルが、前記第２のＴｍより低い温度で測定された前記蛍光シグナルより大きい場合、前記第１のＦＲＥＴカセットおよび前記第２のＦＲＥＴカセットの少なくとも一方が前記反応混合物中で切断されたと決定することを含む、請求項
９
に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月３０日に出願された米国仮出願第６３／２５０，８９４号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益を主張する。この先の出願の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
続きを表示（約 2,400 文字）【０００２】
配列表
ファイルサイズが２７，８８６バイトである、２０２２年４月１６日に作成された「ＤＩＡ０１０５－ＰＣＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」と題する、本明細書と共に提出されたコンピュータ可読配列表の本文は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本開示は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、侵襲的切断反応および単一の蛍光検出チャネルを使用して異なる検体核酸を検出および識別するための組成物、方法、キット、およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
核酸の定量化は、生物学および医学の分野において重要な役割を果たす。例えば、核酸の定量化は、がんの診断および予後、並びに細菌、真菌およびウイルス性病原体によって引き起こされる感染性疾患の診断およびモニタリングに使用される。
【０００５】
単一の反応混合物中の複数の核酸検体を検出することには大きな価値がある。実際、いわゆる「多重」検出は、関連する試薬コストを低減しながら、核酸アッセイの価値を大幅に向上させる。しかしながら、異なるアッセイフォーマットは、異なる範囲への多重化能力に対応し、これは、実際的なトレードオフが存在することを意味する。例えば、次世代シーケンシング技術は、膨大な量の情報の取得を可能にするが、その技術は技術的に非常に困難であり、一般に高度に特殊化された機器を必要とする。「侵襲的切断アッセイ」と呼ばれる別の技術は、単一ヌクレオチド相違（「ＳＮＰ」）のレベルまでの核酸配列検出を可能にし、いくつかの多重アッセイフォーマットに関連して既に使用されている。
【０００６】
例えば、Ｈａｌｌらは、米国特許第５，９９４，０６９号において、侵襲的切断検出方法に関連して有用な２つの多重化アプローチを記載した。第１に、特定の標的配列（または内部対照）の存在は、蛍光エネルギー移動フォーマットの異なる色素等の異なる検出可能な部分にカップリングした異なるカスケードを引き起こすように設計することができる。最終生成物に対する各特異的標的配列の寄与を集計することができ、核酸配列の混合物に含まれる異なる核酸配列の定量的検出が可能になる。第２の構成では、いくつかの検体のいずれかが試料中に存在するかどうかを決定することが望ましいが、それぞれの正確な正体を知る必要はない。例えば、血液バンクでは、血液試料中に感染因子の宿主のいずれか１つが存在するかどうかを知ることが望ましい。血液は、どの作用物質が存在するかにかかわらず廃棄されるため、異なるプローブによって産生される異なるシグナルは、そのような適用では必要とされず、実際には機密性の理由から望ましくない場合がある。したがって、検体間を区別することが不必要または望ましくない場合、単一の検出可能な標識を使用することができる。
【０００７】
他の場所では、Ｐｅｔｅｒｓｏｎらは、公開された米国特許出願第２０１８／０１６３２５９号Ａ１において、異なる温度および異なる時間で二次侵襲的切断反応を行うことによる異なる核酸検体の検出を記載している。ここで、第１の二次侵襲的切断反応は、第２の二次侵襲的切断反応が始まる時点までに完了する。異なる温度下で異なる時間に反応を行うことにより、単一の多重反応において核酸検体を区別することが可能である。
【０００８】
異なるアッセイフォーマットを使用して、Ｋｏｚｌｏｖらは、米国特許第１１，０３４，９９７号において、タグ付き加水分解プローブを使用した標的核酸の検出および定量化のための多重化リアルタイムＰＣＲを実施する方法を教示している。５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼがタグ部を切断し、プローブの残りの部分を加水分解するため、ＰＣＲ反応の各サイクルで単一のプローブ切断事象が起こる。タグが、プローブのアニーリング部上のクエンチャーから分離したフルオロフォアを有する場合、蛍光シグナルを生成することができる。標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブと会合した蛍光標識は、プライマー伸長（すなわち、重合）反応の１サイクルの間に、プローブの標的相補的部分から切断され得、その後分解される。結果として、シグナル強度の増大は、ＰＣＲ反応のさらなるサイクルの実施に依存する。同様に、Ｋｏｚｌｏｖらは、「消光分子」（例えば、オリゴ）が、ＰＣＲのプライマー伸長反応においてプライマーを伸長するために使用される温度で、切断されていない加水分解プローブのタグ部にハイブリダイズすることを教示している。ＰＣＲ反応におけるプライマー伸長サイクルの前に、蛍光は、プローブのアニーリング部および消光分子に連結されたクエンチャー部分によって消光される。
既存の核酸多重検出プラットフォームの利用可能性にもかかわらず、自動試験プラットフォームに容易に適合させることができる追加のアプローチが依然として必要とされている。より具体的には、ハードウェアの変更を必要とせずに、展開された試験機器の検出能力を最大化する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
米国特許第５，９９４，０６９号明細書
米国特許出願公開第２０１８／０１６３２５９号明細書
米国特許第１１，０３４，９９７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
本明細書では、以下の番号が付された実施形態が提供される。
（【００１１】以降は省略されています）

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