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公開番号2025063288
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-15
出願番号2025009884,2023070217
出願日2025-01-23,2014-06-11
発明の名称SC-β細胞及び組成物並びにその生成方法
出願人プレジデントアンドフェローズオブハーバードカレッジ
代理人個人
主分類A61K 35/545 20150101AFI20250408BHJP(医学または獣医学;衛生学)
要約【課題】SC-β細胞及び組成物並びにその生成方法を提供すること。
【解決手段】I型糖尿病を有するヒト対象に投与する方法に使用するための組成物であって、該組成物は、複数の細胞クラスターを含み、該方法は、該対象に該組成物を投与する工程を含み、該複数の細胞クラスターは、グルカゴンを発現する複数の細胞を含み、該組成物中の細胞クラスターの全ては、<300μmの直径を有し、該複数の細胞クラスター中の細胞の少なくとも20%は、複数の非天然の膵臓β細胞であり、該非天然の膵臓β細胞は、
(a)クロモグラニンA、ISL1、PDX1及びC-ペプチド、並びに以下の遺伝子:ZNT8、MNX1又はABCC8の1つ以上を発現し;
(b)ソマトスタチン又はグルカゴンを発現しない、組成物。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｉ型糖尿病を有するヒト対象に投与する方法に使用するための組成物であって、該組成物は、複数の細胞クラスターを含み、該方法は、該対象に該組成物を投与する工程を含み、該複数の細胞クラスターは、グルカゴンを発現する複数の細胞を含み、該組成物中の細胞クラスターの全ては、＜３００μｍの直径を有し、該複数の細胞クラスター中の細胞の少なくとも２０％は、複数の非天然の膵臓β細胞であり、該非天然の膵臓β細胞は、
（ａ）クロモグラニンＡ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１及びＣ－ペプチド、並びに以下の遺伝子：ＺＮＴ８、ＭＮＸ１又はＡＢＣＣ８の１つ以上を発現し；
（ｂ）ソマトスタチン又はグルカゴンを発現しない、組成物。
続きを表示（約 540 文字）【請求項２】
該複数の非天然の膵臓β細胞は、グルコースチャレンジに供された場合に、ｉｎｖｉｔｒｏでのグルコース刺激インスリン分泌応答を示す、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該複数の非天然の膵臓β細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで幹細胞から生成される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
該幹細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
該複数の非天然の膵臓β細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでグルコース刺激カルシウム流動を示す、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
該複数の非天然の膵臓β細胞は、ＺＮＴ８を発現する、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
該複数の非天然の膵臓β細胞は、ＰＣ２を発現する、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
該複数の非天然の膵臓β細胞は、ＭＮＸ１を発現する、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
該複数の非天然の膵臓β細胞は、ＡＢＣＣ８を発現する、請求項１記載の組成物。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１３年６月１１日付けで出願された米国仮出願第６１／８３３，８９８号及び２０１４年３月２８日付けで出願された米国仮出願第６１／９７２，２１２号の利益を主張する。その内容は、その全体が参照により組み込まれる。
続きを表示（約 6,200 文字）【０００２】
本発明は、ＳＣ－β細胞及び組成物並びにその生成方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
今日まで研究において、連続的に変化するグルコースレベルに対する応答において、適切な量のインスリンを分泌しない、異常にのみ機能するインスリン発現細胞、または、マウス宿主への移植後３ヶ月でのみ、機能性インスリン発現細胞に成熟し得る膵臓始原細胞が生成されている（Ｃｈｅｎｇｅｔ．ａｌ．，２０１２；Ｄ’Ａｍｏｕｒｅｔａｌ．，２００５；Ｄ’Ａｍｏｕｒｅｔａｌ．，２００６；Ｋｒｏｏｎｅｔａｌ．，２００８；Ｎｏｓｔｒｏｅｔａｌ．，２０１１；Ｒｅｚａｎｉａｅｔａｌ．，２０１２；Ｓｃｈｕｌｚｅｔａｌ．，２０１２；Ｘｉｅｅｔａｌ．，２０１３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．，Ｙｉｎｇ，Ｌ．，Ｌｕ，Ｌ．，Ｇａｌｖaｏ，Ａ．Ｍ．，Ｍｉｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｌｉｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｋｏｔｔｏｎ，Ｄ．Ｎ．，Ｓｈｅｎ，Ｓ．Ｓ．，Ｎｏｓｔｒｏ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１２）．Ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇｅｎｄｏｄｅｒｍａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｌｉｎｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１０，３７１－３８４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
「グルコース刺激インスリン分泌」（ＧＳＩＳ）アッセイにおける高レベルのグルコースに対する応答において、高レベルのインスリンを放出し、それを繰り返し行い得る、正常な膵島または散在した成体β細胞とは対照的に、既存の方法により生成されたｈＰＳＣ系インスリン発現細胞は、種々の濃度のグルコースの添加に対する応答において、適切にインスリンを分泌できない。したがって、正常な膵島または成熟した成体β細胞の表現型を示す、ｈＰＳＣ由来の細胞の取得方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一部の態様では、本開示は、幹細胞系β細胞（ＳＣ－β）を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、前記細胞は、成熟している。一部の実施形態では、前記細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでのグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、ｉｎｖｉｖｏでのＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏでのグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも１回のグルコースチャレンジに対して、ＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも２回の連続的なグルコースチャレンジに対して、ＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも３回の連続的なグルコースチャレンジに対して、ＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、前記ＧＳＩＳ応答は、前記細胞をヒトまたは動物に移植した直後に観察される。一部の実施形態では、前記ＧＳＩＳ応答は、前記細胞をヒトまたは動物に移植した約２４時間以内に観察される。一部の実施形態では、前記ＧＳＩＳ応答は、前記細胞をヒトまたは動物に移植した約２週間以内に観察される。一部の実施形態では、低グルコース濃度と比較して、高グルコース濃度に対する応答において分泌されたインスリンの割合により特徴付けられる前記細胞の刺激指数は、内在性の成熟膵臓β細胞の刺激指数に類似している。一部の実施形態では、前記刺激指数は、１以上または１．１以上または１．３以上または２以上または２．３以上または２．６以上である。一部の実施形態では、前記細胞は、サイトカインに対する応答において、サイトカイン誘導性アポトーシスを示す。一部の実施形態では、前記サイトカインは、インターロイキン－１β（ＩＬ－β）、インターフェロン－γ（ＩＮＦ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）及びそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記細胞からのインスリン分泌は、抗糖尿病剤に対する応答において亢進する。一部の実施形態では、前記抗糖尿病剤は、インクレチン模倣物、スルホニル尿素、メグリチニド及びそれらの組合せからなる群から選択される分泌促進物質を含む。一部の実施形態では、前記細胞は、モノホルモン性である。一部の実施形態では、前記細胞は、内在性の成熟膵臓β細胞の形態に類似する形態を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、内在性の成熟膵臓β細胞のインスリン顆粒に類似する、電子顕微鏡観察下における封入結晶インスリン顆粒を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、低速の複製を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、内在性の成熟膵臓β細胞のＧＳＣＦに類似するグルコース刺激Ｃａ
２＋
流動（ＧＳＣＦ）を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも１回のグルコースチャレンジに対して、ＧＳＣＦ応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも２回のグルコースチャレンジに対して、ＧＳＣＦ応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも３回のグルコースチャレンジに対して、ＧＳＣＦ応答を示す。一部の実施形態では、前記細胞は、亢進したカルシウム流動を示す。一部の実施形態では、前記亢進したカルシウム流動は、増大した量の流入または、高グルコース濃度に対して低い流入比を含む。一部の実施形態では、前記細胞は、インスリン、Ｃ－ペプチド、ＰＤＸ１、ＭＡＦＡ、ＮＫＸ６－１、ＰＡＸ６、ニューロＤ１、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、ＳＬＣ２Ａ１、ＰＣＳＫ１、ＫＣＮＪ１１、ＡＢＣＣ８、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＮＡＰ２５、ＲＡＢ３Ａ、ＧＡＤ２、ＰＴＰＲＮ、ＮＫＸ２－２、Ｐａｘ４からなる群から選択される、内在性の成熟膵臓β細胞に固有の少なくとも１つのマーカーを発現している。一部の実施形態では、前記細胞は、ａ）ｉ）グルカゴン（ＧＣＧ）及びｉｉ）ソマトスタチン（ＳＳＴ）からなる群から選択されるホルモン、または、ｂ）ｉ）アミラーゼ及びｉｉ）カルボキシペプチダーゼＡ（ＣＰＡ１）からなる群から選択される腺細胞マーカー；ｃ）ｉ）ＧＣＧ、ｉｉ）Ａｒｘ、ｉｉｉ）Ｉｒｘ１及びＩｒｘ２からなる群から選択されるα細胞マーカー；並びに、ｄ）ｉ）ＣＦＴＲ及びｉｉ）Ｓｏｘ９からなる群から選択される管細胞マーカー、からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現していない。一部の実施形態では、前記細胞は、インスリン陽性内分泌細胞または、Ｎｋｘ６－１陽性膵臓始原細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓始原細胞及び多能性幹細胞からなる群から選択されるその前駆体から、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて分化されている。一部の実施形態では、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記細胞はヒトである。一部の実施形態では、前記細胞は、遺伝子組み換えされていない。一部の実施形態では、前記細胞は、遺伝子組み換えされている。一部の実施形態では、前記細胞あたりに産生されるインスリンは、高グルコース濃度での３０分のインキュベートにおいて、細胞１０００個あたりに、０．５と１０μＩＵとの間である。一部の実施形態では、前記細胞あたりに産生されるインスリンは、高グルコース濃度での３０分のインキュベートにおいて、細胞１０００個あたりに、約２．５μＩＵである。一部の実施形態では、前記インキュベートは、ｅｘｖｉｖｏにおいて生じる。
【０００８】
一部の態様では、本開示は、ＳＣ－β細胞を含む細胞株を提供する。一部の実施形態では、前記細胞株は、インスリンを安定的に発現している。一部の実施形態では、前記細胞は、少なくとも３０回の継代まで、明らかな形態変化をすることなく、凍結、解凍及び、約２４と４４時間との間の倍加時間で増幅されることができる。
【０００９】
一部の態様では、本開示は、細胞クラスター形成を促進する条件下において、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集合を、ａ）形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達阻害剤及びｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータを含む少なくとも２つのβ細胞成熟因子と接触させて、前記集合における少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞のＳＣ－β細胞へのｉｎｖｉｔｒｏ成熟を誘導することを含む、インスリン陽性内分泌細胞からのＳＣ－β細胞の生成方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、前記ＳＣ－β細胞は、少なくとも１回のグルコースチャレンジに対する応答を示す。一部の実施形態では、前記ＳＣ－β細胞は、少なくとも２回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す。一部の実施形態では、前記ＳＣ－β細胞は、少なくとも３回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す。一部の実施形態では、前記ＳＣ－β細胞の形態は、内在性の成熟β細胞の形態に類似している。一部の実施形態では、前記ＳＣ－β細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏでのグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す。一部の実施形態では、前記ＧＳＩＳ応答は、前記ＳＣ－β細胞を対象に移植した直後に観察される。一部の実施形態では、前記ＧＳＩＳ応答は、前記ＳＣ－β細胞を対象に移植した約２４時間以内に観察される。一部の実施形態では、前記ＧＳＩＳ応答は、前記ＳＣ－β細胞を対象に移植した約２週間以内に観察される。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１００ｎＭ－１００μＭの間の濃度で、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１０μＭの濃度で、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ－β受容体Ｉ型キナーゼシグナル伝達を含む。一部の実施形態では、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。一部の実施形態では、前記ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体を含む。一部の実施形態では、前記細胞集合を、０．１μＭ－１０μＭの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１μＭの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる。一部の実施形態では、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータは、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の実施形態では、前記細胞集合を、場合により、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記細胞集合を、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない。一部の実施形態では、前記細胞集合を、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１０ｎＭ－１μＭの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１００ｎＭの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記プロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンを含む。一部の実施形態では、前記方法は、前記細胞集合を、少なくとも１つの更なるβ細胞成熟因子と接触させることを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの更なるβ細胞成熟因子は、嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）阻害剤を含む。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１００ｎＭ－１００μＭの間の濃度で、前記ＣＦＴＲ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１０ｎＭ－１０μＭの間の濃度で、前記ＣＦＴＲ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記ＣＦＴＲ阻害剤は、Ｇｌｙ－Ｈ１０１を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つの更なるβ細胞成熟因子は、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害剤を含む。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１００ｎＭ－１００μＭの間の濃度で、前記Ｏ－ＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記細胞集合を、１０ｎＭ－１０μＭの濃度で、前記Ｏ－ＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害剤と接触させる。一部の実施形態では、前記Ｏ－ＧｌｃＮＡｃａｓｅ阻害剤は、ＴｈｉａｍｅｔＧを含む。一部の実施形態では、前記細胞集合は、適切な培養培地中で培養される。一部の実施形態では、前記適切な培養培地は、膵島培地（ＣＭＲＬＳ）またはＣＭＲＬＳの成分を添加した、ＣｏｎｎｏｕｇｈｔＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ１０６６を含む。一部の実施形態では、前記ＣＭＲＬＳは、血清と共に添加される。一部の実施形態では、前記ＣＭＲＬＳは、１０％ウシ胎児血清と共に添加される。一部の実施形態では、前記細胞クラスター形成を促進する条件は、懸濁培養を含む。一部の実施形態では、前記細胞集合は、前記細胞集合中の少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞の少なくとも１つのＳＣ－β細胞へのｉｎｖｉｔｒｏ成熟を誘導するのに十分な期間、懸濁培養において維持される。一部の実施形態では、前記期間は、少なくとも７日を含む。一部の実施形態では、前記期間は、７日と２１日との間を含む。一部の実施形態では、前記期間は、７日と１４日との間を含む。一部の実施形態では、前記期間は、１０日と１４日との間を含む。一部の実施形態では、前記期間は、１４日を含む。一部の実施形態では、前記β細胞成熟因子は、２日に１回補充される。一部の実施形態では、前記細胞集合中の少なくとも１％の前記インスリン陽性内分泌細胞が誘導されて、ＳＣ－β細胞に成熟する。一部の実施形態では、前記集合中の少なくとも９９％の前記インスリン陽性内分泌細胞が誘導されて、ＳＣ－β細胞に成熟する。一部の実施形態では、前記集合中の得られた細胞の少なくとも３０％は、ＳＣ－β細胞を含む。一部の実施形態では、前記ＳＣ－β細胞は、Ｃ－ペプチド、インスリン、ＮＫＸ６－１、Ｐｄｘ１を発現しており、ＮＫＸ６－１とＣ－ペプチドとを共発現している。一部の実施形態では、前記インスリン陽性内分泌細胞は、Ｐｄｘ１及びＮＫＸ６－１も発現している。一部の実施形態では、前記インスリン陽性内分泌細胞は、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集合から産生される。一部の実施形態では、前記ＳＣ－β細胞は、ヒト細胞を含む。一部の実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおける前記ＳＣ－β細胞の生成は、規模を拡大できる。
（【００１１】以降は省略されています）

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