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公開番号2025063118
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-15
出願番号2025001792,2022181703
出願日2025-01-06,2012-11-02
発明の名称移植用中脳ドーパミン(DA)ニューロン
出願人メモリアルスローンケタリングキャンサーセンター
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20250408BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】治療薬としても使用され得る細胞集団を得るための組成物および方法を提供する。
【解決手段】万能性細胞を分化するためのインビトロの方法であって、該方法は、万能性細胞を含む細胞培養においてスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック(SMAD)シグナル伝達の阻害を誘導すること、及びソニックヘッジホッグ(SHH)シグナル伝達の活性化及びウィングレス(Wnt)シグナル伝達の活性化を誘導すること、を含み、ここで、前記Wntシグナル伝達の誘導は、フォークヘッドボックスタンパク質A2(FOXA2)とLIMホメオボックス転写因子1α(LMX1A)の両方を発現する分化した細胞の集団を得るように、前記SMADシグナル伝達の阻害の誘導開始から第3日目～第11日目にわたって前記細胞培養に対し行われる、方法である。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
万能性細胞を分化するためのインビトロの方法であって、
該方法は、
万能性細胞を含む細胞培養においてスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の阻害を誘導すること、及び
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化及びウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化を誘導すること、を含み、
ここで、前記Ｗｎｔシグナル伝達の誘導は、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）とＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）の両方を発現する分化した細胞の集団を得るように、前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害の誘導開始から第３日目～第１１日目にわたって前記細胞培養に対し行われる、方法。
続きを表示（約 1,500 文字）【請求項２】
前記万能性細胞は万能性幹細胞を含み、該万能性幹細胞から分化した細胞の集団の１０％超がＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの両方を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記万能性細胞は万能性幹細胞を含み、該万能性幹細胞から分化した細胞の集団の４０％超がＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの両方を発現する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記万能性細胞が、ヒト、非ヒト霊長類、又はげっ歯類の非胚性幹細胞、胚性幹細胞、人工非胚性万能性細胞及び遺伝子操作万能性細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＨＨシグナル伝達の活性化及びＷｎｔシグナル伝達の活性化の誘導は、前記万能性細胞を、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤、及び少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤に暴露することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記万能性細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害の誘導開始から１１日以内にＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの両方を発現する細胞に分化する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを発現する前記分化した細胞が、Ｇｉｒｋ２、ＣＤ１４２、及びＤＣＳＭ１からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを更に発現する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ａ．前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害の誘導は、前記万能性細胞を、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤に暴露すること；ここで、前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ－１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ノギン、ドルソモルフィン、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される；
ｂ．前記ＳＨＨシグナル伝達の活性化の誘導は、前記万能性細胞を、少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤に暴露すること；ここで、前記少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達活性化剤は、パルモルファミン、組換えＳＨＨ、精製ＳＨＨ、スムーズンドアゴニスト（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄａｇｏｎｉｓｔｓ：ＳＡＧ）、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される；
ｃ．前記Ｗｎｔシグナル伝達の活性化の誘導は、前記万能性細胞を、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤に暴露すること；ここで、前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ１、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される；
の１つ以上を特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａを発現する前記分化した細胞は、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２、及びＬＨＸ２からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害の誘導は、前記万能性細胞を、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤に暴露することを含み；ここで、前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤は、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達阻害剤及び少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達阻害剤を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
政府許認可権
本発明は、部分的に、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）と米国国立神経疾患・脳卒中研究所（ＮＩＮＤＳ）のＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ助成金第ＮＳ０５２６７１号及びＮＩＨ／ＮＩＮＤＳ助成金第Ｐ５０ＮＳ０４７０８５号の下の政府支援を以て行われた。従って、米国政府は本発明にある特定の権利を有する。
続きを表示（約 5,200 文字）【０００２】
本発明の分野
本発明は幹細胞生物学の分野、とりわけ万能性幹細胞又は多能性幹細胞の系譜特異的分化に関連し、それらの幹細胞には非胚性ヒト人工万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に加えてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、体性幹細胞、疾患を有する患者に由来する幹細胞、又は系譜特異的分化が可能である他のあらゆる細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。新規の培養条件を用いて底板中脳始原細胞への、その後さらに、大集団の中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへのｈＥＳＣ及び／又はｈｉＰＳＣの系譜特異的分化を制御する方法が具体的に記載される。本発明の方法を用いて作製された中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンには、インビトロ創薬アッセイにおける使用、神経生物学研究における使用、及び患者におけるドーパミンニューロンの喪失による疾患又は障害を回復させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない様々な使用法がさらに企図される。さらに、疾患、特にパーキンソン病のモデル化に使用するため、ヒト万能性幹細胞から中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための組成物と方法が提供される。加えて、真正ＤＡニューロンはＣＤ１４２などのマーカー及びＡ９型神経細胞に富む。
【背景技術】
【０００３】
多数の特定化した細胞型へ分化する能力を保持する細胞集団は、多数の系譜特異的分化細胞集団の発生にとって有用である。特定化した細胞へさらに分化する能力を保持するこれらの細胞集団は万能性細胞を含有する。万能性細胞の起源は胚性及び／又は非胚性体性幹細胞であり得る。
【０００４】
これらの系譜特異的分化細胞集団は、特定の細胞集団の機能欠損を引き起こす疾患を有する患者への細胞置換療法に使用されると考えられている。それらの細胞集団の直接的な治療上の価値に加えて、系譜特異的分化細胞は、細胞系譜特異的疾患を治療する治療分子の具体的な機能を同定、確認、及び試験するための、又はそれらの分子の送達を試験するためのインビトロスクリーニングアッセイを含む、様々な目的用の有用性が高い研究ツールでもある。
【０００５】
以前、胚性幹細胞と体性幹細胞が神経変性疾患の治療薬及びモデルシステムとして用いられた。胚性幹細胞及び体性幹細胞の制御性分化に関連する研究及び技術開発が、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び多発性硬化症など、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患の分野でなされてきた。しかしながら、これらの研究の結果は、インビボで使用されたこれらの細胞に患者の神経機能を回復させる能力はほとんど無く、多くの場合、患者に好ましくない腫瘍の増殖が生じることを示した。
【０００６】
それ故、特定の機能を有する細胞の喪失を引き起こす疾患を治療するための研究においても、治療薬としても使用され得る細胞集団を得るための組成物と方法が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は幹細胞生物学の分野、とりわけ万能性幹細胞又は多能性幹細胞の系譜特異的分化に関連し、それらの幹細胞には非胚性ヒト人工万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に加えてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、体性幹細胞、疾患を有する患者に由来する幹細胞、又は系譜特異的分化が可能である他のあらゆる細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。新規の培養条件を用いて底板中脳始原細胞への、その後さらに、大集団の中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンへのｈＥＳＣ及び／又はｈｉＰＳＣの系譜特異的分化を制御する方法が具体的に記載される。本発明の方法を用いて作製された中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンには、インビトロ創薬アッセイにおける使用、神経生物学研究における使用、及び患者におけるドーパミンニューロンの喪失による疾患又は障害を回復させる治療薬としての使用を含むが、これらに限定されない様々な使用法がさらに企図される。さらに、疾患、特にパーキンソン病のモデル化に使用するため、ヒト万能性幹細胞から中脳運命ＦＯＸＡ２＋ＬＭＸ１Ａ＋ＴＨ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための組成物と方法が提供される。加えて、真正ＤＡニューロンはＣＤ１４２などのマーカー及びＡ９型神経細胞に富む。
【０００８】
第１シグナル伝達阻害剤、第２シグナル伝達阻害剤及び第３シグナル伝達阻害剤を備えるキットであって、前記第１阻害剤がトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第２阻害剤がスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができ、そして、前記第３阻害剤がウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させることができる前記キット。１つの実施形態では、前記第１阻害剤はＬＤＮ‐１９３１８９である。他の実施形態では、前記第１阻害剤は、ＬＤＮ‐１９３１８９、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記第２阻害剤はＳＢ４３１５４２である。他の実施形態では、前記第２阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記第３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。他の実施形態では、前記第３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記キットはソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）８受容体ファミリーシグナル伝達活性化剤をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アスコルビン酸（ＡＡ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、ジブチリルｃＡＭＰ及びトランスフォーミング増殖因子タイプβ３をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは、抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、抗フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、及び抗ＬＩＭホメオボックス転写因子１α（ＬＭＸ１Ａ）からなる群より選択される抗体をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは、幹細胞、胚性幹細胞、人工万能性幹細胞、及び遺伝子操作細胞からなる群より選択される細胞をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットは始原細胞及び中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを分化させるための指示書をさらに備える。１つの実施形態では、前記キットはパーキンソン病（ＰＤ）を有する患者より細胞を得るための指示書をさらに備える。
【０００９】
第１シグナル伝達阻害剤及び第２シグナル伝達阻害剤と接触する細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団の４０％超がフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）について陽性であり、前記細胞集団がそれまでに第１シグナル伝達阻害剤、第３シグナル伝達阻害剤、及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤と接触しており、前記第１阻害剤がトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）／アクチビン‐ノーダルシグナル伝達を低下させることができ、前記第２阻害剤がウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）シグナル伝達を低下させることができ、そして、前記第３阻害剤がスモールマザーズ・アゲインスト・デカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を低下させることができる前記組成物。１つの実施形態では、前記第１阻害剤は、ＬＤＮ‐１９３１８９、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される小分子である。１つの実施形態では、前記第２阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１及びその阻害剤からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記第３阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達活性化剤はソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）Ｃ２５ＩＩ及びスムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニストからなる群より選択され、その中で前記アゴニストはパルモルファミンである。いくつかの実施形態では、前記細胞集団はさらに線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）と以前に接触した。１つの実施形態では、前記細胞集団を含む前記の大半の細胞はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）
+
ＬＩＭ＋ホメオボックス転写因子１＋、α（ＬＭＸ１Ａ）、
+
ＮＧＮ２＋及びＤＤＣ＋底板中脳始原細胞である。１つの実施形態では、前記細胞集団は、げっ歯類細胞、霊長類細胞及びヒト細胞からなる群より選択される。１つの実施形態では、前記細胞はパーキンソン病（ＰＤ）患者細胞に由来する。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）について少なくとも５０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも６０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも７０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも８０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも９０％陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団はフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２について少なくとも９５％で最大１００％陽性である。
【００１０】
インビトロ細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団を含む大半の細胞がチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）
+
フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）
+
ＬＩＭホメオボックス転写因子１＋、α（ＬＭＸ１Ａ）
+
底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンである、前記組成物。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンの前記４０％超はチロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋）である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも５０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも６０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも７０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも８０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも９０％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。１つの実施形態では、前記細胞集団は少なくとも９５％で最大１００％チロシンヒドロキシラーゼ陽性である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は大半の中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンを含む。１つの実施形態では、前記底板中脳ドーパミン（ＤＡ）ニューロンは、核受容体ＮＵＲＲ１（ＮＲ４Ａ２）、ニューロン特異的ＩＩＩ型β‐チューブリン（Ｔｕｊ１）、ＴＴＦ３、ペアード（ｐａｉｒｅｄ）様ホメオドメイン３（ＰＩＴＸ３）、アカエテ‐スクート（ａｃｈａｅｔｅ‐ｓｃｕｔｅ）複合体（ＡＳＣＬ）、初期Ｂ細胞因子１（ＥＢＦ‐１）、初期Ｂ細胞因子３（ＥＢＦ‐３）及びトランスチレチン（ＴＴＲ）からなる群より選択されるマーカーについて陽性である。１つの実施形態では、前記中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロン集団は、ＤＡ、３，４‐ジヒドロキシ‐フェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）からなる群より選択される分子について陽性である。１つの実施形態では、前記マーカーは、タンパク質及び核酸からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロン集団はパーキンソン病（ＰＤ）患者からなる群より選択される患者においてインビボで移植することができる。１つの実施形態では、前記中脳運命ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ＋ドーパミン（ＤＡ）ニューロンはインビボで移植することができ、そして、ドーパミン（ＤＡ）神経機能を提供することができる。
（【００１１】以降は省略されています）

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