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公開番号2025061501
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-10
出願番号2025007900,2022513269
出願日2025-01-20,2020-08-27
発明の名称卵内複製のための安定化されたHAを持つ組換えインフルエンザウイルス
出願人ウィスコンシンアルムニリサーチファンデイション,国立大学法人東京大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 7/01 20060101AFI20250403BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】ウイルス複製を改善している、従ってワクチンウイルスの収量を改善する、改変されたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼが、本明細書において説明される。
【解決手段】インフルエンザウイルスによるそのような改変されたノイラミニダーゼの発現はまた、同時発現されたヘマグルチニンを安定化させ、その結果ヘマグルチニンは、変異を受けないか、又は細胞へのHA結合の必要性を減少する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＮＡ中の複数の選択された残基又は残基欠失をコードしている選択されたＮＡウイルス分節を含む、分離された組換えインフルエンザウイルスであって：
ここで、この選択されたＮＡウイルス分節は、残基１４８にトレオニン（Ｔ）又はリジン（Ｋ）を有するＮＡをコードせず、１５１位にアスパラギン酸（Ｄ）をコードせず、２４５位にアスパラギン（Ｎ）をコードせず、３２９位にトレオニンをコードせず、３４４位にリジンをコードせず、３４６位にグリシン（Ｇ）をコードせず、残基３４７にヒスチジン（Ｈ）をコードせず、及び３６９位にトレオニンをコードせず、ここで番号付けはＮ２を基にしており、ここでこの組換えインフルエンザウイルスは、鳥卵において増殖される場合に、残基１４８にトレオニンもしくはリジンをコードし、残基１５１にアスパラギン酸をコードし、残基２４５にアスパラギンをコードし、残基３２９にトレオニンをコードし、残基３４４にリジンをコードし、残基３４６にグリシンをコードし、残基３４７にヒスチジンをコードし、及び３６９位にトレオニンをコードしているＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比べ、鳥卵において増強された複製を有するか、減少されたシアリダーゼ活性を有するか、α２－３シアロシドへの増強された結合を有するか、又はＨＡ変異の減少を有するか；
ここで、この選択されたＮＡウイルス分節は、残基１４８にイソロイシン（Ｉ）を有するＮＡをコードし、並びに１５１位にアスパラギン酸をコードせず、２４５位にアスパラギン（Ｎ）をコードせず、３２９位にトレオニンをコードせず、３４４位にリジンをコードせず、３４６位にグリシンをコードせず、残基３４７にヒスチジンをコードせず、及び３６９位にトレオニンをコードせず、ここで番号付けはＮ２を基にしており、ここでこの組換えインフルエンザウイルスは、鳥卵において増殖される場合に、残基１４８にトレオニンもしくはリジンをコードし、残基１５１にアスパラギン酸をコードし、残基２４５にアスパラギンをコードし、残基３２９にトレオニンをコードし、残基３４４にリジンをコードし、残基３４６にグリシンをコードし、残基３４７にヒスチジンをコードし、及び３６９位にトレオニンをコードしているＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比べ、鳥卵において増強された複製を有するか、減少されたシアリダーゼ活性を有するか、α２－３シアロシドへの増強された結合を有するか、又はＨＡ変異の減少を有するか；
ここで、この選択されたＮＡウイルス分節は、３２９位にセリンを有するＮＡをコードし、及び３４４位にグルタミン酸をコードし、ここで番号付けはＮ２を基にしており、ここでこの組換えインフルエンザウイルスは、鳥卵において増殖される場合に、残基３２９にトレオニンもしくはアスパラギンをコードしているか、又は残基３４４にリジンをコードしているＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比べ、鳥卵において増強された複製を有するか、減少されたシアリダーゼ活性を有するか、α２－３シアロシドへの増強された結合を有するか、又はＨＡ変異の減少を有するか；或いは、
ここで、この選択されたＮＡウイルス分節は、残基１４８にトレオニン又はリジンを有するＮＡをコードせず、残基３２にトレオニンをコードせず、１５１位にアスパラギン酸をコードせず、２４５位にアスパラギンをコードせず、残基３２９にアスパラギンもしくはトレオニンをコードせず、３４４位にリジンをコードせず、３４６位にグリシンをコードせず、残基３４７にヒスチジンをコードせず、及び／もしくは残基３６９にトレオニンをコードしないか、又は残基４６から５０に１又は複数の欠失を有するＮＡを含むか、又はその任意の組合せであり、ここで番号付けはＮ２を基にしており、ここでこの組換えインフルエンザウイルスは、鳥卵において増殖される場合に、残基１４８にトレオニンもしくはリジン及び残基３２にトレオニンをコードしているか、残基４６から５０に欠失を有さないか、１４７位にアスパラギン酸を有するか、残基１５１にアスパラギン酸を有するか、残基２４５にアスパラギンを有するか、残基３２９にアスパラギンもしくはトレオニンを有するか、残基３４６にグリシンを有するか、残基３４７にヒスチジンを有するか、残基３６９にトレオニンを有するか、又はその任意の組合せであるＮＡを有する対応するインフルエンザイウルスと比べ、鳥卵において増強された複製を有するか、減少されたシアリダーゼ活性を有するか、α２－３シアロシドへの増強された結合を有するか、又はＨＡ変異の減少を有する、分離された組換えインフルエンザウイルス。
続きを表示（約 2,300 文字）【請求項２】
前記選択されたＮＡ分節が、残基１４８にトレオニンをコードせず、残基２４５にアスパラギンをコードせず、残基３６９にトレオニンをコードせず、残基１５１にアスパラギン酸をコードせず、残基３４４にリジンをコードせず、残基３４６にグリシンをコードせず、残基３４７にヒスチジンをコードせず、及び残基３６９にトレオニンをコードしない、請求項１記載の組換えウイルス。
【請求項３】
前記選択されたＮＡ分節が、残基１４８にリジンもしくはイソロイシン、残基１５１にグルタミン酸（Ｅ）、残基２４５にセリン（Ｓ）、トレオニン、グリシン、アラニン（Ａ）、ロイシンもしくはイソロイシン、残基３２９にセリン、グリシン、アラニン、ロイシンもしくはイソロイシン、残基３４４にグルタミン酸、アスパラギン酸もしくはヒスチジン、残基３４６にバリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニンもしくはセリン、残基３４７にグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンもしくはトレオニン、又は残基３６９にリジン、ヒスチジン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸を有する、１４８、１５１、２４５、３２９、３４４、３４７、又は３６９位の２つ以上をコードしている、請求項１記載の組換えウイルス。
【請求項４】
前記選択されたＮＡウイルス分節が、残基１４８にトレオニンを有するＮＡをコードせず、及び１５１位にアスパラギン酸、２４５位にアスパラギン、残基３４６にバリン、セリン、イソロイシンもしくはロイシン、残基３４７にヒスチジン、又は残基３６９にトレオニンを有するか、又はその任意の組合せであるＮＡをコードせず、ここで番号付けはＮ２を基にしており、ここでこの組換えインフルエンザウイルスは、鳥卵において増殖される場合に、残基１４８にトレオニン、残基１５１にアスパラギン酸、残基２４５にアスパラギン、残基３４７にヒスチジン、及び残基３６９にトレオニンをコードしているか、又はその任意の組合せであるＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比べ、鳥卵において増強された複製を有するか、又はＨＡ変異の減少を有するか；或いは、ここで前記選択されたＮＡウイルス分節が、残基１４８にトレオニン又はリジンを有するＮＡをコードせず、及び１５１位にアスパラギン酸、２４５位にアスパラギン、残基３４６にバリン、セリン、イソロイシンもしくはロイシン、残基３４７にヒスチジン、又は残基３６９にトレオニンを有するか、又はその任意の組合せであるＮＡをコードせず、ここで番号付けはＮ２を基にしており、ここでこの組換えインフルエンザウイルスは、鳥卵において増殖される場合に、残基１４８にトレオニンもしくはリジン、残基１５１にアスパラギン酸、残基２４５にアスパラギン、残基３４６にグリシン、残基３４７にヒスチジン、及び残基３６９にトレオニンをコードしているか、又はその任意の組合せであるＮＡを有する対応するインフルエンザウイルスと比べ、鳥卵において増強された複製を有するか、又はＨＡ変異の減少を有する、請求項１記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項５】
前記選択されたＮＡウイルス分節が、残基１４８にイソロイシン、ロイシン、グリシン又はアラニンを有するＮＡをコードしている、請求項１記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項６】
３２位の残基が、Ａ、Ｉ、Ｇ、もしくはＬであるか、前記欠失が、残基４６から５０の欠失であるか、１４７位の残基が、Ｎもしくはグルタミン（Ｑ）であるか、３２９位の残基が、Ｄもしくはグルタミン酸であるか、又は３４６位の残基が、セリン、Ｔ、プロリン（Ｐ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、Ａ、Ｎ、Ｉ、もしくはＬである、請求項１記載の分離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項７】
１４８位の残基が、Ｉであるか、１５１位の残基が、Ｅ、ＮもしくはＱであるか、２４５位の残基が、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｖ、もしくはＧであるか、３４７位の残基が、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＣもしくはＷであるか、３６９位の残基が、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ｐ、もしくはＤであるか、又はその任意の組合せである、請求項１記載の分離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項８】
３２９位の残基が、セリン、バリン、アラニン、Ｇ、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシンもしくはロイシンであるか、又は３４６位の残基が、Ｖ、Ｓ、Ｔ、プロリン、チロシン、トリプトファン、Ａ、Ｎ、Ｉ、もしくはＬである、請求項１記載の分離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項９】
１４８位の残基が、Ｉであるか、１５１位の残基が、Ｅ、ＮもしくはＱであるか、２４５位の残基が、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｖ、もしくはＧであるか、３２９位の残基が、Ｓ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｖ、もしくはＧであるか、３４４位の残基が、Ｅ、Ｈ、Ｄ、ＮもしくはＱであるか、３４６位の残基が、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｗ、Ｙ、もしくはＰであるか、３４７位の残基が、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＣもしくはＷであるか、又は３６９位の残基が、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ｐ、もしくはＤである、請求項１記載の分離された組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
リアソータントである、請求項１～９のいずれか一項記載の分離された組換えインフルエンザウイルス。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２７日に出願された米国特許出願第６２／８９２，２４１号の出願日の利益を主張するものであり、その出願の開示は引用により本明細書中に組み込まれている。
続きを表示（約 3,300 文字）【０００２】
政府基金の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＵＨ）により与えられたＨＨＳＮ２７２２０１４００００８Ｃの下で、政府支援により成された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
インフルエンザは、ウマを含む一部の哺乳類における主要な呼吸器疾患であり、且つ毎年の実質的罹患及び経済的損失の原因となっている。加えてインフルエンザウイルス感染症は、一部の鳥類の種において重篤な全身性疾患を引き起こし、死亡に繋がり得る。インフルエンザウイルスゲノムの分節化された性質は、２種以上のインフルエンザウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製時の分節の再集合を可能にする。遺伝子変異及び浮動と組合せられた分節の再集合は、時間とともにインフルエンザウイルスの無数の多様な株を生じ得る。新規株は、それらのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質において抗原性の変動を示し、並びに特にＨＡタンパク質の遺伝暗号は、高い割合の可変性を有する。流感を予防する主要な現在の実践は、ワクチン接種である。最も一般的には、不活化されたウイルスワクチンが使用される。インフルエンザＨＡタンパク質は、そのウイルスに対する宿主の防御免疫応答の主要な標的抗原であり、且つ高度に可変性であるので、インフルエンザウイルスの分離並びに最新の大流行に関連したウイルスのＨＡ抗原の確定及び特徴決定は、ワクチン製造に重要である。蔓延と予測を基に、ワクチンは、支配的で且つ予測されるインフルエンザウイルス株に対する防御免疫応答を刺激するように設計される。
【０００４】
インフルエンザウイルスの４種の一般的型、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型及びＤ型が存在し、これらはそれらの内部タンパク質間の血清学的な交差反応性の非存在により定義される。Ａ型インフルエンザウイルスは更に、それらの糖タンパク質であるＨＡ及びＮＡタンパク質の抗原性及び遺伝子の差異を基に亜型に分類される。公知のＨＡ及びＮＡ亜型（Ｈ１からＨ１８まで及びＮ１からＮ１１まで）は全て、水鳥から分離されており、これらはインフルエンザの自然界の貯蔵庫として働いていると考えられる。
【０００５】
ほとんどのインフルエンザワクチンは、発育鶏卵において製造される。しかしＷＨＯが推奨したインフルエンザワクチン株は、発育鶏卵内では効果的に複製されないことが多く、それらのウイルスの馴化を可能にするために、卵内で連続継代されることが必要である。卵内での馴化及び増幅時に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は頻繁に、卵馴化変異を獲得する。ＨＡにおけるこれらの卵馴化変異は、そのウイルスの抗原性を頻繁に変更し、結果的に循環ウイルス株に対しもはや最適にマッチしないワクチンウイルスを生じる。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本明細書記載のように、インフルエンザウイルスは、馴化時に６種の非－免疫原性ウイルス分節に生じた変異を試験するために、卵内で７回継代された（３つ組で）。驚くべきことに、このウイルスは、ＨＡ変異を獲得せず、代わりに、ＮＡ、ＰＢ２、ＮＰ、及びＭ１タンパク質に変異を有した。このＮＡ変異は、３つの実験全てにおいて同一であり、且つこれは１つの欠失及び４つのアミノ酸変異を含んだ。ＮＡ変異のみを試験し、これは、例えば単独で又は様々な組合せにおいて、ＨＡ変異を伴わずに卵内の効率的増殖を可能にする作用に寄与したことがわかった。
【０００７】
従って本開示は、卵内での増殖時に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）分節において、抗原性を損なう変異を獲得することを妨げるインフルエンザ変異に関する。ヒトインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質における変異は、卵継代時にＨＡを「安定化させる」ことがわかり、例えばＮＡ中に変異が存在する場合、ＨＡタンパク質は、卵馴化変異を獲得しなかった。それらのＮＡ変異はまた、ワクチンウイルス収量を増加することもできる。
【０００８】
本開示は、ＮＡ中の特定の位置に選択されたアミノ酸残基又は欠失を伴う、分離された組換えインフルエンザウイルス、例えばリアソータント(reassortant)なインフルエンザウイルスを提供する。
【０００９】
一実施態様において、ＮＡは、残基３２にトレオニンをコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、１４７位にアスパラギン酸（Ｄ）をコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基３２９にアスパラギン（Ｎ）をコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基１４８又は残基３２９にトレオニン（Ｔ）をコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基１４８又は残基３４４にリジン（Ｋ）をコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基３４６にグリシン（Ｇ）をコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基３４７にヒスチジン（Ｈ）をコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基３４７にアルギニン（Ｒ）又はアスパラギンをコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基３６９にトレオニンをコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、１４８位にトレオニン又はリジンを有するＮＡをコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、１５１位にアスパラギン酸を有するＮＡをコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、２４５位にアスパラギンを有するＮＡをコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、３４６位にグリシンを有するＮＡをコードしないように選択される。一実施態様において、ＮＡは、残基４６から５０に１又は複数の欠失を有するように選択される。ＮＡに関する番号付けは、Ｎ２を基にしている。一実施態様において、本開示は、ワクチンインフルエンザウイルス、例えばＰＲ８ＵＷ由来の６種の「内部」ウイルス分節、特定の位置に１又は複数の特定された残基もしくは特定された残基の欠失、もしくはその任意の組合せを伴うＮＡウイルス分節、並びに例えば循環インフルエンザウイルス由来のＨＡウイルス分節、例えばＨ１－Ｈ１８のいずれかを有する、分離された組換えリアソータントなインフルエンザウイルスを提供する。組換えインフルエンザウイルスを含有する組成物、ワクチンなどの医薬組成物も同じく提供される。
【００１０】
従って、例えば卵内など細胞内で増殖又は継代されるワクチンウイルスに関して、番号付けはＮ２を基にし、例えば変異による、ＮＡにおける３２、１４７、３２９、３４７位での残基の置換え、又は残基４６から５０の１もしくは複数の欠失、又はその任意の組合せ、或いは残基３２にトレオニンをコードしないか、１４７位にアスパラギン酸をコードしないか、残基３２９にアスパラギンをコードしないか、残基３４７にヒスチジンをコードしないか、残基３６９にトレオニンをコードしないか、又は残基４６から５０の１又は複数の欠失を有するか、又はその任意の組合せであるようなＮＡに関するＮＡウイルス分節の選択は、ＨＡの安定化及び／又はより高いウイルス力価を生じ得る。一実施態様において、例えば卵内など細胞内で増殖又は継代されるワクチンウイルスに関して、番号付けはＮ２を基にし、例えば変異による、ＮＡにおける１４８、１５１、２４５、３４６位での残基の置換え、又はその任意の組合せ、或いは残基１４８にトレオニン又はリジンをコードしないか、１５１位にアスパラギン酸をコードしないか、残基２４５にアスパラギンをコードしないか、残基３４６にグリシンをコードしないか、又はその任意の組合せであるようなＮＡに関するＮＡウイルス分節の選択は、ＨＡの安定化及び／又はより高いウイルス力価を生じ得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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