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公開番号2025060777
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-04-10
出願番号2024226305,2022557407
出願日2024-12-23,2021-10-06
発明の名称遺伝子多型検出方法
出願人株式会社島津製作所,国立研究開発法人国立循環器病研究センター
代理人弁理士法人NSI国際特許事務所
主分類C12Q 1/6883 20180101AFI20250403BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】迅速かつ被験者への侵襲性が低い、ApoE遺伝子多型の新たな検出方法を提供すること。
【解決手段】本発明として、例えば、被験者から採取されたゲノムDNAに存在するアポリポ蛋白Eの遺伝子多型を検出するための方法であって、次の1～3のステップを含む遺伝子多型検出方法を挙げることができる。
1.唾液からDNAを遊離した検体を作製するステップ、
2.当該DNAを含む検体に、(1)PCR酵素、(2)アポリポ蛋白E遺伝子の核酸断片を増幅するためのPCRプライマー対、ならびに(3)アポリポ蛋白Eの遺伝子多型を検出するためのオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブセットを添加し混合するステップ、
3.PCRを行い、そのPCR産物からアポリポ蛋白Eの遺伝子多型に応じた蛍光強度を測定するステップ。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
被験者から採取されたゲノムＤＮＡに存在するアポリポ蛋白Ｅの遺伝子多型を検出するための方法であって、次の１～３のステップを含む、遺伝子多型検出方法：
１．被験者から採取された上皮細胞を含む外分泌液または粘液からＤＮＡを遊離し、当該ＤＮＡを含む検体を作製するステップ、
２．当該ＤＮＡを含む検体に、
（１）ＰＣＲ酵素、
（２）アポリポ蛋白Ｅの１１２番目または１５８番目のアミノ酸残基（ＣｙｓまたはＡｒｇ）をコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対、ならびに
（３）アポリポ蛋白Ｅの１１２番目のアミノ酸残基が野生型であるＣｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブおよび当該１１２番目のアミノ酸残基が変異型であるＡｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブのセットであって、標識に用いる蛍光色素が互いに異なる蛍光標識プローブセット、
またはアポリポ蛋白Ｅの１５８番目のアミノ酸残基が野生型であるＡｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブおよび当該１５８番目のアミノ酸残基が変異型であるＣｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブのセットであって、標識に用いる蛍光色素が互いに異なる蛍光標識プローブセットを添加し混合するステップ、
３．前記混合物に対しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物から当該被験者のアポリポ蛋白Ｅの１１２番目または１５８番目のアミノ酸残基に応じた蛍光強度を測定するステップ。
続きを表示（約 3,100 文字）【請求項２】
前記ステップ１において、界面活性剤およびプロテアーゼＫを用いてＤＮＡを遊離する、請求項１に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項３】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムである、請求項２に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項４】
前記検体に、さらに、塩化カリウム、塩化マグネシウム、およびｄＮＴＰミックスを含むトリス塩酸緩衝液を添加し混合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項５】
前記検体に、さらにＰＣＲ酵素に吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であって、ＰＣＲを阻害する物質に結合し、当該負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を添加し混合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項６】
前記外分泌液または粘液が唾液である、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項７】
前記唾液を、綿棒、脱脂綿、吐出、ＤＮＡ採取キットによって採取する、請求項６に記載の遺伝子多型検出方法。
【請求項８】
前記ＰＣＲプライマー対が、次の配列番号１および配列番号２、もしくは配列番号３および配列番号４、または配列番号５および配列番号６、もしくは配列番号７および配列番号８で表される塩基配列の対である、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
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79
170
【請求項９】
蛍光標識プローブ中における、アポリポ蛋白Ｅの１１２番目のアミノ酸残基が野生型であるＣｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドの塩基配列、および当該１１２番目のアミノ酸残基が変異型であるＡｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドの塩基配列が、それぞれ次の配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列であって、アポリポ蛋白Ｅの１５８番目のアミノ酸残基が野生型であるＡｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドの塩基配列、および当該１５８番目のアミノ酸残基が変異型であるＣｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドの塩基配列が、それぞれ次の配列番号１１および配列番号１２で表される塩基配列である、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
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【請求項１０】
被験者から採取されたゲノムＤＮＡに存在するアポリポ蛋白Ｅの遺伝子多型を判定するための方法であって、次の１および２のステップを含む、遺伝子多型判定方法：
１．請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法によって、１１２番目のアミノ酸残基および１５８番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線を取得する工程、
２．（ａ）前記工程で取得した１１２番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
野生型Ｃｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブ（１１２番目Ｃｙｓプローブ）に由来する蛍光強度のみ実質的な増加が観察され、変異型Ａｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブ（１１２番目Ａｒｇプローブ）に由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されず、かつ
前記工程で取得した１５８番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
野生型Ａｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブ（１５８番目Ａｒｇプローブ）に由来する蛍光強度のみ実質的な増加が観察され、変異型Ｃｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブ（１５８番目Ｃｙｓプローブ）に由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されない場合、アボリポ蛋白Ｅ３／Ｅ３と判定する工程、
（ｂ）前記工程で取得した１１２番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１１２番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度のみ実質的な増加が観察され、１１２番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されず、かつ
前記工程で取得した１５８番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１５８番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されず、１５８番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度のみ実質的な増加が観察された場合、アボリポ蛋白Ｅ２／Ｅ２と判定する工程、
（ｃ）前記工程で取得した１１２番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１１２番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度のみ実質的な増加が観察され、１１２番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されず、かつ
前記工程で取得した１５８番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１５８番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加が観察され、また１５８番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加も観察された場合、アボリポ蛋白Ｅ２／Ｅ３と判定する工程、
（ｄ）前記工程で取得した１１２番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１１２番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されず、１１２番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度のみ有意な増加が観察され、かつ
前記工程で取得した１５８番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１５８番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度のみ実質的な増加が観察され、１５８番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されない場合、アボリポ蛋白Ｅ４／Ｅ４と判定する工程、
（ｅ）前記工程で取得した１１２番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１１２番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度も１１２番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度も実質的な増加が観察され、かつ
前記工程で取得した１５８番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１５８番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度のみ実質的な増加が観察され、１５８番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度の実質的な増加が観察されない場合、アボリポ蛋白Ｅ３／Ｅ４と判定する工程、または
（ｆ）前記工程で取得した１１２番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１１２番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度も１１２番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度も実質的な増加が観察され、かつ
前記工程で取得した１５８番目のアミノ酸残基に基づく増幅曲線において、
１５８番目Ａｒｇプローブに由来する蛍光強度も１５８番目Ｃｙｓプローブに由来する蛍光強度も実質的な増加が観察された場合、アボリポ蛋白Ｅ２／Ｅ４と判定する工程。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子多型検出方法の技術分野に属する。本発明は、アポリポ蛋白Ｅ（以下、「ＡｐｏＥ」ともいう。）遺伝子の多型を検出する方法に関するものである。詳しくは、本発明は、唾液等の外分泌液からＡｐｏＥ遺伝子多型を検出する方法に関するものである。
続きを表示（約 3,300 文字）【背景技術】
【０００２】
ＡｐｏＥは、２９９個のアミノ酸からなる分子量３４，２００Ｄａのタンパク質である。そのＡｐｏＥ遺伝子にはε２、ε３、およびε４の対立遺伝子（アリル）があり、それぞれの遺伝子によりコードされる３種類の主要なアイソフォームＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４が存在する。これらは１１２番目と１５８番目の２カ所のアミノ酸残基が異なっており、ＡｐｏＥ２はＣｙｓ／Ｃｙｓ、ＡｐｏＥ３はＣｙｓ／Ａｒｇ、ＡｐｏＥ４はＡｒｇ／Ａｒｇである。これらの中、１１２番目のアミノ酸残基がＣｙｓで、１５８番目のアミノ酸残基がＡｒｇであるＡｐｏＥ３が野生型であり、最も頻度が多い。ＡｐｏＥ２およびＡｐｏＥ４は、変異型である。
ＡｐｏＥは、コレステロール輸送やリポ蛋白代謝など脂質代謝に関わる分子であり、肝臓リパーゼ、リポ蛋白リパーゼ、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼなどの脂質代謝酵素の活性化に関与している。
【０００３】
アルツハイマー型認知症（ＡＤ）の発症や認知機能障害（ＭＣＩなど）に関わるリスク遺伝子は数多く報告されているが、その中でもＡｐｏＥは最も強力なリスク遺伝子である。そして、高齢発症ＡＤにおいて、ＡｐｏＥ４の頻度が高いことが確認され、ＡｐｏＥ２の頻度が低いことが報告されている。さらには、ＡｐｏＥ４の頻度は若齢発症型と高齢発症型とにおいて女性ではほぼ同じであるのに対して、男性では高齢発症型の方が若齢発症型より高いこと、ＡｐｏＥ４／４はＡＤの発症年齢を５～１０歳程度早めること、ＡｐｏＥ４／４を有するＡＤ患者はＡＤ治療薬に対する反応性が低く、糖代謝率も低いこと、脳萎縮はＡｐｏＥ４／４、ＡｐｏＥ３／４、ＡｐｏＥ３／３の順に進行しやすいことなども知られている。
【０００４】
また、他の認知症である血管性認知症（ＶＤ）やレビー小体病などではＡｐｏＥ４の頻度が高いこと、脳アミロイドアンギオパチーによる脳出血患者では、ＡｐｏＥ２の頻度が高いことなども知られている。
加えて、パーキンソン病、統合失調症、うつ病、不安障害、てんかんといった精神神経疾患においては、ＡｐｏＥ４の頻度が高いことが報告されている。
【０００５】
上記の通り、ＡｐｏＥ遺伝子多型は、ＡＤ等の発症リスクを知る上で重要な因子と考えられる。
従来、ＡＤの発症診断や予測をする際には、例えばＭＲＩ（ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅＩｍａｇｉｎｇ：磁気共鳴画像診断装置）やＣＴ（ＣｏｍｐｕｔｅｄＴｏｍｏｇｒａｐｈｙ）の画像から判断するのが一般的である。しかし、ＭＲＩ画像を撮影するには一定の時間が必要であり、患者への負担も大きい。そのため、より迅速に判定できる、ＡｐｏＥ遺伝子多型の情報を用いたＡＤの発症診断や予測方法の研究が行われている。
これまでのＡｐｏＥ遺伝子多型の測定は、通常、被験者から血液を採取して行われている。例えば、特許文献１には、血液サンプル中のＡｐｏＥ４またはその断片を検出する方法が開示されている。非特許文献１には、リアルタイムＰＣＲを用いてＡｐｏＥ遺伝子多型が検出されている。このような血液をサンプルにしてＡｐｏＥ遺伝子多型を検出する方法は侵襲性が高く、依然として被験者への負担が大きいことが問題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特表２０１９－５３６００７号公報
【非特許文献】
【０００７】
ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４５，Ｎｏ．７，１９９９，ｐｐ．１０９４－１０９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまでのＡｐｏＥ遺伝子多型の測定は、通常、被験者から血液を採取して行われており、侵襲性が高く、画像診断と同様に依然として被験者への負担が大きい。
本発明は、迅速かつ被験者への侵襲性が低く、上記のような課題を解決しうるＡｐｏＥ遺伝子多型の新たな検出方法ないし判定方法を提供することを主な課題とする。また、そのためのキットやシステムなども提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、唾液等の外分泌液から簡便迅速にＡｐｏＥ遺伝子多型を検出でき、これにより上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
【００１０】
［１］被験者から採取されたゲノムＤＮＡに存在するアポリポ蛋白Ｅの遺伝子多型を検出するための方法であって、次の１～３のステップを含む、遺伝子多型検出方法：
１．被験者から採取された上皮細胞を含む外分泌液または粘液からＤＮＡを遊離し、当該ＤＮＡを含む検体を作製するステップ、
２．当該ＤＮＡを含む検体に、
（１）ＰＣＲ酵素、
（２）アポリポ蛋白Ｅの１１２番目または１５８番目のアミノ酸残基（ＣｙｓまたはＡｒｇ）をコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片を増幅するためのＰＣＲプライマー対、ならびに
（３）アポリポ蛋白Ｅの１１２番目のアミノ酸残基が野生型であるＣｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブおよび当該１１２番目のアミノ酸残基が変異型であるＡｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブのセットであって、標識に用いる蛍光色素が互いに異なる蛍光標識プローブセット、
またはアポリポ蛋白Ｅの１５８番目のアミノ酸残基が野生型であるＡｒｇをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブおよび当該１５８番目のアミノ酸残基が変異型であるＣｙｓをコードするコドンを含む、アポリポ蛋白Ｅ遺伝子の核酸断片に結合するオリゴヌクレオチドを有する蛍光標識プローブのセットであって、標識に用いる蛍光色素が互いに異なる蛍光標識プローブセットを添加し混合するステップ、
３．前記混合物に対しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物から当該被験者のアポリポ蛋白Ｅの１１２番目または１５８番目のアミノ酸残基に応じた蛍光強度を測定するステップ。
［２］前記ステップ１において、界面活性剤およびプロテアーゼＫを用いてＤＮＡを遊離する、上記［１］に記載の遺伝子多型検出方法。
［３］前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムである、前記［２］に記載の遺伝子多型検出方法。
［４］前記検体に、さらに、塩化カリウム、塩化マグネシウム、およびｄＮＴＰミックスを含むトリス塩酸緩衝液を添加し混合する、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
［５］前記検体に、さらにＰＣＲ酵素に吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であって、ＰＣＲを阻害する物質に結合し、当該負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を添加し混合する、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
［６］前記外分泌液または粘液が唾液である、上記［１］～［５］のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
［７］前記唾液を、綿棒、脱脂綿、吐出、ＤＮＡ採取キットによって採取する、上記［６］に記載の遺伝子多型検出方法。
［８］前記ＰＣＲプライマー対が、次の配列番号１および配列番号２、もしくは配列番号３および配列番号４、または配列番号５および配列番号６、もしくは配列番号７および配列番号８で表される塩基配列の対である、上記［１］～［７］のいずれか一項に記載の遺伝子多型検出方法。
（【００１１】以降は省略されています）

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