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公開番号2025041969
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-26
出願番号2024233233,2022038216
出願日2024-12-30,2022-03-11
発明の名称希釈または非精製試料における核酸の正確な並行定量のための方法
出願人ゲノミルヘルスオサケユイチア,Genomill Health Oy
代理人個人
主分類C12Q 1/6806 20180101AFI20250318BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】大量の試料(最大数十ミリリットル)、ならびに/または希釈かつ/もしくは非精製試料材料からの高度にスケーラブルで正確な標的定量のために次世代シーケンシングを使用する方法を提供する。
【解決手段】本開示は、主に遺伝子標的および変異体の検出に使用される、複雑なDNAプール中の遺伝子標的を検出および定量するためのプローブを含む方法およびキットに関する。本発明は、非常に不純な試料、例えばこれらに限定されないが、尿、生検、唾液および他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿(液体生検)などを含む、ヒトまたは動物の身体から得られた試料において疾患を引き起こす遺伝子変異を検出する分野での特定の用途を見出す。本発明は、遺伝子標的毎に1以上の標的特異性核酸プローブ(左プローブおよび右プローブ)、および架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を使用する。
【選択図】図2B
特許請求の範囲【請求項１】
複数の試料中の１以上の標的ヌクレオチド配列をハイスループット検出する方法であって、
（ｉ）前記各試料中の各標的ヌクレオチド配列に、
第１のプローブ、第２のプローブおよび架橋オリゴまたは互いにアニーリングして架橋オリゴ複合体を形成することができる複数のオリゴヌクレオチド、を提供し、
前記第１のプローブは、分子の５’末端から出発し、第１の架橋オリゴ特異性配列、選択的に第１の配列バーコード、および第１のプローブの３’末端に第１の標的特異性部分を含み；
前記第２のプローブは、分子の５’末端から出発し、第２の標的特異性部分、選択的に第２の配列バーコード、および第２のプローブの３’末端に第２の架橋オリゴ特異性配列を含み；
前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体は、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブのそれぞれの前記第１の架橋オリゴ特異性配列および前記第２の架橋オリゴ特異性配列に相補的な配列、及び、選択的に第３のバーコードを有し；
前記第１の配列バーコードまたは前記第２の配列バーコードまたは前記第３のバーコードの少なくとも１つが、それぞれ前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体中に存在し；
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体の少なくとも１つが、第１の捕捉部分を含む、工程と、
（ｉｉ）前記１以上の各標的ヌクレオチド配列について、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブを、好ましくは別個のチューブ内の前記試料の各々について、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を形成できる複数のオリゴヌクレオチドと接触させ、複数のライゲーション複合体への自己アニーリングを可能にする工程と、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記試料の各々に存在する核酸を、前記ライゲーション複合体と接触させる工程と、
（ｉｖ）前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの各前記第１の標的特異性部分および前記第２の標的特異性部分を、前記標的配列上の本質的に隣接する部分にハイブリダイズさせて、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程と、
（ｖ）前記ハイブリダイゼーション複合体を、第２の捕捉部分を含む固体支持体と接触させ、前記ハイブリダイゼーション複合体が前記固体支持体に連結されるように、前記第１の捕捉部分と前記第２の捕捉部分とを相互作用させる工程と、
（ｖｉ）前記固体支持体に連結されていない前記試料の成分から、前記固体支持体に連結したハイブリダイゼーション複合体を分離する工程と、
（ｖｉｉ）前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記プローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたライゲーション複合体を供給する工程と、
（ｖｉｉｉ）選択的に、前記複数の試料から前記ライゲーションされたライゲーション複合体をプールする工程と、
（ｉｘ）１以上の前記ライゲーションされたライゲーション複合体から核酸を増幅する工程と、
（ｘ）工程（ｉｘ）で得られた前記核酸をハイスループットシーケンシング技術に供して、前記バーコード配列を決定する工程と、および
（ｘｉ）前記第１の標的特異性部分および／または前記第２の標的特異性部分の少なくとも一部、および／または前記第１のバーコードおよび／または前記第２のバーコードの少なくとも一部、および／または前記第３のバーコードの少なくとも一部を決定することによって、前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在および／または数を特定する工程と、を含み、
前記工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）が、任意の順序で実行され得る方法。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記複数の試料が、血液試料、唾液試料、尿試料または糞便試料、他の体液の試料または身体物質からの抽出物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の捕捉部分がビオチン部分であり、前記第２の捕捉部分がストレプトアビジン部分またはアビジン部分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｖｉ）と（ｖｉｉ）との間に洗浄工程が行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記シーケンシングが次世代ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンシングによって行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のプローブの３’末端または前記第２のプローブの５’末端、またはその両方が、前記第１のプローブが前記第２のプローブへ化学的にライゲーションできるように修飾される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のプローブまたは前記第２のプローブ、またはその両方の架橋部分が、前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体への結合を改善させるための化学修飾された塩基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の標的特異性部分、前記第２の標的特異性部分、前記第１の架橋オリゴ特異性配列、および／または前記第２の架橋オリゴ特異性配列が、互いに独立して１以上の化学修飾ヌクレオチドを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が、前記第１のプローブ、前記第２のプローブまたは前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体に存在し、
工程（ｉｘ）における前記増幅が、前記ライゲーションされたライゲーション複合体に組み込まれた前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからＲＮＡ合成を開始するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する前記１以上のライゲーションされたライゲーション複合体からのＲＮＡ合成を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、または前記架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体が、ウラシル特異的切除試薬を用いた切断による線状化を可能にするデオキシウリジン部分を含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、１以上の核酸標的を正確に、かつ大規模に並行して定量するための改良された次世代ＤＮＡシーケンシング方法に関する。より詳細には、本開示は、主に遺伝子標的および変異体の検出に使用される、複雑なＤＮＡプール中の遺伝子標的を検出および定量するためのプローブを含む方法およびキットに関する。本発明は、非常に不純な試料、例えばこれらに限定されないが、尿、生検、唾液および他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検）などを含む、ヒトまたは動物の身体から得られた試料において疾患を引き起こす遺伝子変異を検出する分野での特定の用途を見出す。本発明は、遺伝子標的毎に１以上の標的特異性核酸プローブ（左プローブおよび右プローブ）、および架橋オリゴまたは架橋オリゴ複合体を使用する。
続きを表示（約 2,700 文字）【背景技術】
【０００２】
ある植物および動物における遺伝的変異の検出は、研究技術の進歩によって、面倒なものではない。しかしながら、特に弱いシグナルを有する試料における突然変異などの遺伝子変異の検出および正確な定量は、シーケンシングコストの低下にもかかわらず、現在依然として面倒で、労力を要し、高価である。コンセンサスバックグラウンドに対する遺伝子シグナルを検出するための特異性、弱い遺伝子シグナルを検出するための感度、検出されたシグナルを正確に定量するための精度、アッセイあたりの標的化遺伝子標的のスループット数、アッセイあたりのコスト、複数の試料を並行してアッセイする場合のアッセイコスト規模を決定するための評価、および試料採取から結果までの時間の長さを決定するためのターンオーバーなど、様々な問題はより正確に示されうる。
【０００３】
現在、液体生検の典型的な定量方法および概念的に類似したアッセイ（抗生物質耐性遺伝子検出など）には、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、アレイｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、または次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの定量が含まれる。定量方法は確固とした、かつ良好に確立された方法であるが、各方法は、以下により詳細に説明する特定の問題に関連している。
【０００４】
定量ＰＣＲ：定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ中の、すなわちリアルタイムでの標的ＤＮＡ分子の増幅を含む技術である。リアルタイムＰＣＲは、定量的に（定量的リアルタイムＰＣＲ）、および半定量的に、すなわち一定量のＤＮＡ分子より多い／少ない（半定量的リアルタイムＰＣＲ）場合、に使用され得る。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、遺伝子標的定量の絶対的な基準である。現在、ｑＰＣＲ反応の実験室コストは約２ドルである。しかしながら、反応を準備するための相当な実践時間（労働コスト）、標準曲線の必要性、および各定量化標的についての反復を考慮に入れると、事実、実際のコストははるかに高い。各遺伝子標的について別個の定量実験が必要とされるため、実践時間の量は、試料数の増加に伴って急激に変化する。
【０００５】
アレイＰＣＲ：ＰＣＲアレイは、関連する経路または疾患に焦点を当てた遺伝子のパネルの発現を分析するための最も信頼性の高いツールである。９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１００ウェルディスクのＰＣＲアレイは、それぞれ、焦点を当てた遺伝子パネルの徹底的に研究されたパネルのためのSYBR Green最適化プライマーアッセイを含む。ｑＰＣＲ技術のより新しい反復法は、個々のｑＰＣＲ反応を小型化するアレイｑＰＣＲである。アレイＰＣＲは、個々のｑＰＣＲ反応のコストを下げ、複数の標的および試料に対する方法のスケーラビリティを改善する。しかしながら、この方法は、現在、チップあたり数千ドルのコストに、さらに読み出し基礎設備の大きな資本を加えたコストで、１２個の試料からの３８４個の標的（または逆に３８４個の試料からの１２個の標的）に限定されている。従って、前記機構を使用した数千の試料のプロファイリングは、依然として極端に費用が高い。
【０００６】
デジタルＰＣＲ：デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲ、またはｄｅＰＣＲ）は、液滴マイクロ流体および蛍光検出によって標的の絶対定量を提供する方法である。この方法論は比較的費用対効果が高い（試料あたり１つの標的のコストは約３ドル）が、各試料の各標的についてそれぞれ実験を準備し、設定し、実行するための実践時間は、数千の試料規模には不十分である。
【０００７】
多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）は、個々の試料中の複数の遺伝子標的の検出を単純化するためのアプローチを提供する。しかしながら、ＭＬＰＡは、標的の相対的な定量しか提供せず、各試料について別個の検出実験を必要とする。さらに最近では、ＭＬＰＡの変形は、ＤＮＡのバーコード化からコンセプトを導入する。このコンセプトは、従来のＭＬＰＡワークフローよりも良好な定量的分離および試料多重化を可能にする。
【０００８】
次世代シーケンシングベースのアプローチ：次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、配列ベースの遺伝子発現分析をアナログ技術の「デジタル」代替物にするハイスループットシーケンシングとしても知られる。次世代ＤＮＡシーケンシングデータからの標的計数は、ＤＮＡシーケンシングのコストが低下し続けるにつれてますます魅力的になってきており、現在、例えばＮＩＰＴスクリーニングで使用されている。しかしながら、現在のアプローチは、高いシーケンシングライブラリー調製コスト、および関連性のない遺伝子標的のシーケンシングに浪費されるシーケンシング労力に悩まされている。例えば、癌関連液体生検では、非標的化アプローチは、腫瘍学的に関連性のない遺伝子座に対するシーケンシング労力の浪費をもたらす。胎児診断において、遺伝子座の非標的化試料採取は、データを解釈するための統計的選択肢をかなり制限する。ＧｕａｒｄａｎｔＨｅａｌｔｈＩｎｃは、より標的化されたシーケンシングアプローチを提供し、それはＲＮＡ捕捉プローブのアレイが次世代ＤＮＡシーケンシングの標的を濃縮する。
【０００９】
Ａｋｈｒａｓら（２００７）ＰＬｏＳＯＮＥ２（２）：ｅ２２３は、バーコード化標的特異性プローブ、標的環状化およびシーケンシングを含む多重病原体検出アッセイを開示している。標的特異性プローブをライゲーションするための架橋オリゴヌクレオチドの使用も開示される。
国際公開第２０１９／０３８３７２号は、目的の標的配列を選択的に増幅し、シーケンシングする次世代シーケンシングアプローチを記載している。この方法は、試料中の多くの標的配列の正確かつ並行した検出および定量を可能にするが、より複雑で大量かつ／または不純な試料は、依然として困難である。
したがって、前記議論に照らして、前記の欠点、例えば、これらに限定されないが、核酸標的の正確かつ大規模に並行した定量を通じた特異性、感度、精度、スループット、コスト、評価およびターンオーバーを克服する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
国際公開第２０１９／０３８３７２号公報
【非特許文献】
（【００１１】以降は省略されています）

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