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公開番号2025041773
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-26
出願番号2024225562,2022133647
出願日2024-12-20,2017-06-30
発明の名称微生物バイオマスのための改善された従属栄養生産方法およびバイオ製品
出願人クーンルアグロシステムズ,インコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人
主分類C12P 23/00 20060101AFI20250318BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】アスタキサンチンを生成する微細藻類細胞を培養する方法により製造されたアスタキサンチンを含む製品を提供する。
【解決手段】(1)有機酸由来の炭素を含む培養培地を提供するステップ;(2)通性従属栄養生物でありヘマトコッカス属の種に分類される微細藻類より、ストレス下でシスト形成に抵抗する成長の急速な運動性細胞であり、低栄養条件における従属栄養性運動細胞型の新規表現型である微細藻類を選択する工程を含む、アスタキサンチンを生成する微細藻類細胞を提供するステップ;(3)暗条件で培養して、微細藻類細胞から培養物を生成するステップを含み、培養培地が、窒素の主要供給源として尿素を含み;微細藻類細胞中のアスタキサンチンの合成が、有機酸由来の炭素の存在下で1以上の硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、および尿素から選択される栄養素を枯渇させた培養培地で起こる、方法により製造されたアスタキサンチンを含む製品。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
下記方法：
(1)有機酸由来の炭素を含む培養培地を提供するステップと；
(2)通性従属栄養生物でありヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）に分類される微細藻類より、ストレス下でシスト形成に強硬に抵抗する成長の急速な運動性細胞であり、非常に低い栄養条件における従属栄養性運動細胞型の新規表現型である微細藻類を選択する工程を含み、
前記非常に低い栄養条件における従属栄養性運動細胞型の新規表現型を選択する工程は、光源を容器の上に置いたときに走光性である能力に基づいて、前記運動性の細胞型をシストから単離することにより行われる、前記目的の生成物を生成する微細藻類細胞を提供するステップと；
(3)前記微細藻類細胞を前記培養培地中、暗条件で培養して、前記微細藻類細胞から微細藻類培養物を生成するステップと；
(4)前記微細藻類細胞を、１２０時間以内に、かつ、前記微細藻類培養物中の前記細胞がシストへの細胞分化を受ける前に、前記微細藻類培養物から単離するステップと；および
(5)前記微細藻類細胞から前記目的の生成物を精製するステップと
を含み、
微細藻類培養物を生成する前記微細藻類細胞の培養に用いられる培養培地が、窒素の主要供給源として尿素を含み；
前記微細藻類細胞中の前記目的の生成物の合成が、有機酸由来の炭素の存在下で１以上の硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、および尿素から選択される栄養素を枯渇させた培養培地で起こる、方法
により製造されたアスタキサンチンを含む製品
。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記微細藻類細胞が、偏性従属栄養生物にされた通性従属栄養生物である、請求項１に記載の
製品
。
【請求項３】
下記方法：
(1)有機酸由来の炭素を含む培養培地を提供するステップと；
(2)通性従属栄養生物でありヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）に分類される微細藻類より、ストレス下でシスト形成に強硬に抵抗する成長の急速な運動性細胞であり、非常に低い栄養条件における従属栄養性運動細胞型の新規表現型である微細藻類を選択する工程を含み、
前記非常に低い栄養条件における従属栄養性運動細胞型の新規表現型を選択する工程は、光源を容器の上に置いたときに走光性である能力に基づいて、前記運動性の細胞型をシストから単離することにより行われる、前記目的の生成物を生成する微細藻類細胞を提供するステップと；
(3)前記微細藻類細胞を前記培養培地中、暗条件で培養して、前記微細藻類細胞から微細藻類培養物を生成するステップと；
(4)前記微細藻類細胞を、１２０時間以内に、かつ、前記微細藻類培養物中の前記細胞がシストへの細胞分化を受ける前に、前記微細藻類培養物から単離するステップと；および
(5)前記単離された細胞を濃縮、乾燥、粉末化、または粉砕するステップと、
を含み、
微細藻類培養物を生成する前記微細藻類細胞の培養に用いられる培養培地が、窒素の主要供給源として尿素を含み；
前記微細藻類細胞中の前記目的の生成物の合成が、有機酸由来の炭素の存在下で１以上の硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、および尿素から選択される栄養素を枯渇させた培養培地で起こる、方法
から製造されたアスタキサンチンを含む微細藻類バイオマス
。
【請求項４】
前記対象製品の合成が、硫酸塩および尿素から選択される1種以上の栄養素を除去した培養液中で、有機酸の炭素の存在下で行われる場合、前記製品が、総カロテノイドの５０％以上７７％以下のアスタキサンチンを含む、請求項１に記載の製品。
【請求項５】
前記微細藻類細胞における目的生成物の合成が、硫酸塩および尿素から選択される１種以上の栄養素を欠いた培養液中で、有機酸の炭素の存在下で起こる場合、前記製品が、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１ω９、Ｃ１８：１ω７、Ｃ１８：２ω６、Ｃ１８：３ω３およびＣ２０：４ω６＋Ｃ２０：５ω３を含む脂肪酸を含む、請求項１に記載の製品。
【請求項６】
前記バイオマスが、硫酸塩および尿素から選択される１種以上の栄養素を除去した培養液中で、有機酸の炭素の存在下で、微細藻類細胞における目的生成物の合成が起こる場合、総カロテノイドの５０％以上７７％以下のアスタキサンチンを含む、請求項３に記載のバイオマス。
【請求項７】
微細藻類細胞における目的生成物の合成が、硫酸塩および尿素から選択される１種以上の栄養素を欠いた培地中で、有機酸の炭素の存在下で、目的の生成物の合成が微細藻類細胞内で起こる場合、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１ω９、Ｃ１８：１ω７、Ｃ１８：２ω６、Ｃ１８：３ω３およびＣ２０：４ω６＋Ｃ２０：５ω３のみからなる脂肪酸を含む、請求項３に記載のバイオマス。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物からバイオマスおよびバイオ製品を生成するための改善された発酵方
法に関する。一実施形態では、本発明は、光誘導および細胞分化を必要とせずに、例えば
、より高い細胞密度まで延長された加速成長、および有用な化合物の生成のために、通性
従属栄養微生物を従属栄養的に培養することを採用する発酵方法に関する。本発明の微生
物は、本明細書に記載の本発明の方法または他の態様における使用のために選択され、突
然変異させられ、または遺伝子操作されうる。
続きを表示（約 4,900 文字）【背景技術】
【０００２】
環境を保護する一方、その長期の健康に影響を及ぼす手ごろな価格の天然で安全かつ有
効な製品に対する世界的な消費者の要求が増している。微生物中で発現された組換え分子
は、市場で現在使用されている持続不可能なまたは問題のある製品または成分の代用にな
りうる。イソプレノイド類は、そのような製品中の成分を含む化合物の別の大きなクラス
を構成する。組換え技術およびイソプレノイド経路は、非限定的な例を挙げると、色素、
テルペン、ゴム、ビタミン、芳香剤、香味料、溶媒、ステロイド／ステロール、ホルモン
／成長調節因子、飼料添加物、栄養化合物、滑沢剤添加物およびさらに殺虫剤のような多
数の商業的に有用な標的化合物を生み出す。次にこれらは、食品および飲料、香水、飼料
、化粧品、ならびに化学薬品、栄養補給食品（neutraceuticals）、医薬品および他の工
業応用のための製品において使用される。
【０００３】
そのようなイソプレノイドの１つは、抗酸化剤、抗炎症剤および着色剤として使用され
るカロテノイド類と呼ばれる天然の色素性化合物のクラスである。ヒトは、その抗酸化剤
の主要供給源としてカロテノイド類に依存している。橙赤色の色素であるアスタキサンチ
ン（３，３’－ジヒドロキシ－ｂ，ｂ’－カロテン－４，４’－ジオン）は、多数の治療
適用のある最も効能のある既存のカロテノイドであると考えられる。アスタキサンチンの
適用に関する世界市場は、２０１４年における２８０メートルトンから２０２０年までに
６７０メートルトンを超える。自然のアスタキサンチンの不十分な入手可能性と高価格は
、市販のアスタキサンチンの約９７％が合成である（Ｅ１６１Ｊと称される）という結果
をもたらす。化学合成されたアスタキサンチンは、エステル化されておらず、よって酸化
に対して極めて感受性であるが、自然に微細藻類中に見出されるそのエステル化形態は、
安定であってより高いバイオアベイラビリティと効能を示す。合成アスタキサンチンは、
魚類および動物の飼料に広く使用されており、ヒトの栄養サプリメント、医療適用、化粧
品およびスキンケアにある程度使用されている。これは、ピンク色の肉を発色させたり、
養殖されたサケ科魚類（サケおよびマス）、マダイに加えて他の動物の成長を促進したり
するために、飼料添加物として使用されている。これは、自然の藻類アスタキサンチンの
約３分の１から６分の１の値段である。しかしながら、食品を着色するために石油由来の
合成化学薬品を使用する慣行に異議が唱えられている。この理由により、米国食品医薬品
局は、小売業者に養殖サケおよびマスに「色付けされている」と標識することを要求して
いる。
【０００４】
合成色素使用の代用として、よりいっそう低価格の天然の同等物が必要とされる。赤色
酵母（キサントフィロマイセス・デンドロラウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ
ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ））は、真核微生物様の微細藻類であるが、その好気性発酵に
より、微細藻類や野生のサケで見出される優勢で好ましい形態とは同一でなくそれらより
劣る化学的形態の３Ｒ、３’Ｒ異性体として、エステル化されていない遊離のアスタキサ
ンチンがもたらされる。後者に関しては、通常総アスタキサンチンの９５％超が、３Ｓ、
３’Ｓ異性体としてのモノエステルおよびジエステルの形態である。赤色酵母アスタキサ
ンチンの販売価格は、微細藻類アスタキサンチンのそれよりもずっと低いが、化学合成さ
れたものよりもなお高い。不利なことに、赤色酵母は速い成長速度を有する一方、比較的
低い色素含有量を有することから、低収率にもかかわらず持続不可能な高い生産コストを
もたらす。
【０００５】
近年、赤色酵母由来のアスタキサンチンについての発酵生産目標は、すべてが１２０時
間のサイクル時間内にある、以下のようなある特定の基準：時間あたり２ｍｇ／Ｌのカロ
テノイド類の生産性；６０ｇ／Ｌの収穫密度；および４ｍｇ／ｇ（０．４％）乾燥重量の
アスタキサンチン収率を満たす場合に、合成アスタキサンチンとコスト競争力があるよう
にモデル化された。このフレームワークを１つの例として使用して、微細藻類のような他
の微生物由来のアスタキサンチンのファーメンターベースの従属栄養生産のための競合的
基準を設定するために、生産性基準が相対的に調整される場合もあり、さらに、価値の異
なるカロテノイド前駆体および関連するイソプレノイド分子の生産のためにさらに調整さ
れる場合もある。経済および持続可能性の計算も、赤色酵母のために使用されるグルコー
スよりもむしろ有機酸の使用における要素として考慮に入れる場合もある。
【０００６】
これまで微細藻類由来のアスタキサンチンのすべての工業生産が、レースウェイ型培養
槽／池および光バイオリアクター中での液内培養において、クラミドモナス目（Chlamydo
monadales）のヘマトコッカス（Haematococcus）由来の唯一の種類の微細藻類を培養する
方法により、屋外または屋内で、太陽光の下または人工照明の下のいずれかで実行される
光合成を採用することが問題である。最も一般的な工業用の種は、ヘマトコッカス・プル
ビアリス（Haematococcus pluvialis）である。この藻類は、カロテノイド類の最も豊富
な供給源であり、通常、アスタキサンチンをその乾燥重量の３％まで、または５％までも
シストとして産生する（LorenzおよびCysewski、2000年；米国特許第６０２２７０１号）
。アセチルＣｏＡに起源を有し、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびフィトエン
を介して色素性前駆体および最終的にアスタキサンチンとなる、ベータカロテン、カンタ
キサンチンおよびルテインのような他のカロテノイド類も存在する。これらは一緒になっ
て、合成アスタキサンチン中には提供されない有用で健康に良い分子カクテルを提供する
。
【０００７】
別の問題は、ヘマトコッカス（Haematococcus）由来のアスタキサンチンの現在の生成
が、供給を制限する難題をはらんでいることである。天然の色素の不足は、価格上昇を推
し進める。結果として、合成アスタキサンチンは、高容量の水産養殖および動物飼料セク
ターにおける着色剤としての使用に追いやられ、一方で微細藻類アスタキサンチンが、食
物サプリメントおよび化粧品のようなヒトへの適用のための主要供給源になる。不利なこ
とに、天然の藻類アスタキサンチンが合成品と価格で対抗したとしても、約３００トンの
色素に合う飼料体積は、今日光合成により生産されるものの１０倍を超える１０，０００
トンの藻類バイオマス（３％の色素含有量と推定して）が抽出のために生産されることを
必要とする。
【０００８】
アスタキサンチン生成の難題のうちの１つは、緑色栄養マクロ独立細胞（ｇｒｅｅｎ
ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｍａｃｒｏｚｏｏｉｄｓ）から赤色不動胞子（ヘマトシスト（ｈ
ａｅｍａｔｏｃｙｓｔｓ））への細胞分化を必要とする、ヘマトコッカス（Haematococcu
s）の複雑な生活環に関係する。約１０ｐｇ／細胞の栄養段階における基礎的アスタキサ
ンチン含有量は、シスト形成プロセスの間、約３０ｐｇ／細胞を有する茶色から赤色の無
鞭毛性で非運動性の未成熟シスト、次いで約６１３ｐｇ／細胞を有する成熟シストの形成
とともに増加する。このプロセスは、シスト形成の誘導およびアスタキサンチンの蓄積に
長期間を必要とし、これだけで、赤色酵母酵母のためのものを含む液内培養のバッチおよ
びフェドバッチ工業発酵に使用される合計サイクル時間、典型的に７～１０日間（１６８
～２４０時間）を超える。
【０００９】
国際公開第２００３０２７２６７号パンフレットは、２つの段階：段階１、その間に、
細胞が光合成独立栄養成長をすることができる緑色運動性二鞭毛性段階；および段階２、
その間に、好ましくない条件下でこれらの細胞がその運動性を喪失することにより、大量
のアスタキサンチンおよび他のカロテノイド類の合成を伴ってシストを形成するシスト形
成段階、を介して、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）を培養
することにより、アスタキサンチン富化バイオマスを生産するための光依存性プロセスを
教示している。好ましくない条件は、強烈な光、栄養素の枯渇、または温度、ｐＨもしく
は塩分濃度の変化うちの１つまたは複数であり、これらは、生物に防御反応としてシスト
を形成させる。国際公開第２００３０２７２６７号パンフレットに記載のプロセスは開放
の池の系を使用し、米国特許第６，０２２，７０１号および同第５，８８２，８４９号は
、多様な構成の光バイオリアクターおよび光バイオリアクターと池の組合せの使用によっ
て可能になる類似した光依存性の２段階プロセスを教示している。米国特許第６，０２２
，７０１号は、光の下での栄養成長のための栄養豊富な培地の使用、そして、その後に続
く無機炭素（二酸化炭素）の存在下、光の下でのアスタキサンチンの蓄積を誘導するため
の栄養枯渇培地の使用をさらに教示している。
【００１０】
そのようなプロセスは、バイオマスを成長させるために光合成のための光に依存するこ
とにより、およびそこからアスタキサンチンに富むバイオマスを収穫する前に緑色運動性
細胞を赤色のシストに変換するために、２段階プロセスの培養に依存することにより、不
利となる。一般に光は太陽光により供給され、よって天気、季節性または成長度合いが荒
れ模様の日々、光を減少させる公害、および地理的位置は、変りやすい生産性および減少
した生産性も助長する。原生動物による捕食によるバイオマスの崩壊または喪失もさらに
減少した生産性をもたらす。屋内のレースウェイ型培養槽または光バイオリアクターの場
合、太陽光は人工照明に置換されうるが、光への曝露のための十分な表面積および適切な
培養ハンドリングをなお必要とし、アスタキサンチン生成のための緑色および赤色相をな
お必要とする。２段階培養法は、複雑な培養操作を含み、シスト形成段階だけでも収穫ま
で多くの日数、通常７～１０日間を必要とし、よって、完全な生産および収穫周期の完了
のために、バイオマス成長相を超えてかなりの時間が加わる。これらのシストは、厚く固
い細胞壁のために消化不可能であり、抽出、生成物調合またはバイオアベイラビリティの
ための色素にアクセスするためにはこじ開けるかまたは細かく砕かなければならない。
（【００１１】以降は省略されています）

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