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公開番号2025039879
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-21
出願番号2025006726,2020102499
出願日2025-01-17,2020-06-12
発明の名称目的タンパク質の製造方法
出願人ナガセヴィータ株式会社
代理人弁理士法人WisePlus
主分類C12N 9/50 20060101AFI20250313BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】宿主細胞に特段の遺伝子操作を行うことなく、薬剤耐性遺伝子等を用いずに、ベクターを安定的に維持しながら目的タンパク質を製造する方法を提供する。
【解決手段】ベクターで形質転換された細胞を培養する工程を含む目的タンパク質の製造方法であって、前記ベクターが目的タンパク質の遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子、リコンビナーゼの認識配列、および細胞の生存に必須な遺伝子を含まないことを特徴とする、製造方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ベクターで形質転換された細胞を培養する工程を含む、酵素の製造方法であって、
前記細胞が放線菌であり、
前記酵素がプロテアーゼであり、
前記ベクターが、プラスミドベクターｐＩＪ１０１由来の複製開始配列、および前記酵素の遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子、リコンビナーゼの認識配列、細胞の生存に必須な遺伝子、ｓｔｉ配列、および溶菌遺伝子を含まないことを特徴とする、製造方法。
続きを表示（約 260 文字）【請求項２】
細胞の生存に必須な遺伝子が、リボソームリサイクリング因子をコードする遺伝子、または翻訳開始因子をコードする遺伝子である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記酵素の遺伝子が、メタロエンドペプチダーゼ遺伝子、またはホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子に由来するプロモーターの制御下にある、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記酵素の遺伝子が、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）遺伝子に由来するターミネーターの制御下にある、請求項１または２に記載の製造方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質の製造方法に関する。
続きを表示（約 1,800 文字）【背景技術】
【０００２】
食品の保存性、味、食感などの向上のために、さまざまな酵素が用いられている。酵素は、本来は微生物や植物等の天然の生体内や細胞外に存在するタンパク質である。酵素は、微生物培養や細胞培養、植物栽培等により工業的に生産し、精製して用いられている。また、酵素の生産性を向上させるために、それらを遺伝子組換えにより大量発現させる場合がある。
【０００３】
自然界では、染色体ＤＮＡの他にプラスミドＤＮＡをもつ生物が知られている。プラスミドＤＮＡを、人為的に目的タンパク質を発現させるためのベクターとして改良し、宿主細胞に新たな機能を付与する技術が一般的に知られている。この遺伝子組換えによるタンパク質の発現は、当該タンパク質の遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を培養することにより行われる。ここで、宿主細胞にとってベクターは不要な外来因子にすぎないため、培養を継続する間にベクターが脱落しやすいという問題がある。この問題を回避するために、宿主細胞内でベクターを安定的に維持する種々の方法が開発されている。
【０００４】
ベクターを安定的に維持するために最も広く用いられる方法は、ベクターにタンパク質の遺伝子に加えて抗生物質耐性遺伝子を導入し、宿主細胞を抗生物質の存在下で培養する方法である。宿主細胞は抗生物質耐性遺伝子なくして生きることができないため、抗生物質耐性遺伝子を含むベクターも安定的に維持される。しかし、抗生物質耐性遺伝子が酵素製品に混入するリスクがある。また、抗生物質耐性遺伝子や抗生物質自体の環境中への流出により耐性菌の発生につながる懸念もある。
【０００５】
そこで、宿主細胞の生育が一定以上に達したときに、抗生物質耐性遺伝子をベクターから選択的に切り出して除去する方法が提案されている（特許文献１～２）。その他に、本来宿主が持っている必須遺伝子を宿主から欠損させて、その遺伝子をベクターに導入する方法（特許文献３）、リコンビナーゼの認識配列をベクターに導入する方法（非特許文献１～２）、宿主細胞にとって有毒な物質を発現する遺伝子を宿主のゲノムに保持し、対応する解毒用遺伝子をベクターに導入する方法（非特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
特開第２００８－５０５６２０号公報
特開第２０１３－５３３７４３号公報
特表第２０１７－５０００４２号公報
【非特許文献】
【０００７】
ＢｏＺｈａｎｇｅｔａｌ．ＰＬｏＳＯＮＥ８（２）：ｅ５５９０６（２０１３）
ＹｕａｎＹｕｅｔａＬ．ＰＬｏＳＯＮＥ８（５）：ｅ６２４５７（２０１３）
Ｓｅｖｉｌｌａｎｏｅｔａｌ．ＭｉｃｒｏｂＣｅｌｌＦａｃｔ（２０１７）１６：１６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１～２の方法では、抗生物質の使用量は低減できるが、抗生物質耐性遺伝子の酵素製品への混入リスクは排除できない。特許文献３の方法では宿主細胞の必須遺伝子を欠損させる必要があり、非特許文献１～３の方法ではベクターに目的タンパク質以外の特定の配列を導入する必要がある。本発明の課題は、宿主細胞に特段の遺伝子操作を行うことなく、薬剤耐性遺伝子等を用いずに、ベクターを安定的に維持しながら目的タンパク質を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者が検討した結果、宿主細胞に特段の遺伝子操作を行うことなく、薬剤耐性遺伝子を用いずに、ベクターを安定的に維持させ得ることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ベクターで形質転換された細胞を培養する工程を含む目的タンパク質の製造方法であって、前記ベクターが目的タンパク質の遺伝子を含み、抗生物質耐性遺伝子、リコンビナーゼの認識配列、および細胞の生存に必須な遺伝子を含まないことを特徴とする、製造方法に関する。
（【００１１】以降は省略されています）

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