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公開番号2025039446
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-21
出願番号2023146555
出願日2023-09-08
発明の名称吸入性化学物質の有害性予測方法
出願人学校法人産業医科大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/6851 20180101AFI20250313BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】肺胞マクロファージのモデル実験系を使った吸入性化学物質の有害性を予測する方法を提供すること。
【解決手段】本発明の方法は、(1)試験物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたRNAから、試験物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のmRNAの相対発現量のリスト(L_T)を得るステップと、(2)前記LTtと、陽性対照物質及び陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のmRNAの相対発現量のリスト(L_PC)及び(L_NC)とに基づく判別分析により、試験物質の有害性の高低を予測するステップとを含み、前記判別指標遺伝子群は、Ahcyl1等の18種類の遺伝子である。本発明は本発明の方法に用いるための配列番号1及び/若しくは2等のヌクレオチド配列等を含む、プライマーの対等も提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
吸入性化学物質である試験物質の有害性の高低を予測する方法であって、
（１）試験物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから、試験物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量のリスト（Ｌ
Ｔ
）を得るステップと、
（２）前記Ｌ
Ｔ
と、陽性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量のリスト（Ｌ
ＰＣ
）及び陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量のリスト（Ｌ
ＮＣ
）とに基づく判別分析により、試験物質の有害性の高低を予測するステップとを含む、
方法。
続きを表示（約 2,000 文字）【請求項２】
前記判別指標遺伝子群は、Ａｈｃｙｌ１、Ａｓａｈ１、Ａｔｘｎ１０、Ｃｌｐｂ、Ｃｏｇ６、Ｃｒｏｔ、Ｃｕｔａ、Ｆａｍ１７３ａ、Ｆａｍ９６ａ、Ｎｕｓａｐ１、Ｏａｔ、Ｐｄｉａ６、Ｒｐｓ６ｋａ１、Ｒｓｌ１ｄ１、Ｓｃ５ｄ、Ｔｉｍｅｌｅｓｓ、Ｘｒｃｃ６及びＹａｒｓからなる、又は、を含む群である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験物質は吸入性無機化学物質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験物質の有害性は肺障害性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌ
ＰＣ
は、
（ａ）陽性対照物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから得られた、前記陽性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量と、
（ｂ－１）前記陽性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における内部標準遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量、及び／又は
（ｂ－２）前記陽性対照物質の溶媒のみを投与された細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量とから決定され、
前記Ｌ
ＮＣ
は、
（ｃ）陰性対照物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから得られた、前記陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量と、
（ｄ－１）前記陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における内部標準遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量、及び／又は
（ｄ－２）前記陰性対照物質の溶媒のみを投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量とから決定され、
前記Ｌ
Ｔ
は、
（ｅ）試験物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから得られた、前記試験物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量と、
（ｆ－１）前記試験物質肺細胞由来の細胞における内部標準遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量、及び／又は
（ｆ－２）前記試験物質の溶媒のみを投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量とから決定される、
請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記試験物質、陽性対照物質及び／又は陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、配列番号１及び／若しくは２、３及び／若しくは４、５及び／若しくは６、７及び／若しくは８、９及び／若しくは１０、１１及び／若しくは１２、１３及び／若しくは１４、１５及び／若しくは１６、１７及び／若しくは１８、１９及び／若しくは２０、２１及び／若しくは２２、２３及び／若しくは２４、２５及び／若しくは２６、２７及び／若しくは２８、２９及び／若しくは３０、３１及び／若しくは３２、３３及び／若しくは３４、並びに、３５及び／若しくは３６のヌクレオチド配列か、該ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列かを含む、若しくは、からなる、プライマーの対、プローブ又は１本鎖環状テンプレートを用いて定量される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記試験物質、陽性対照物質及び／又は陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、配列番号１及び２、３及び４、５及び６、７及び８、９及び１０、１１及び１２、１３及び１４、１５及び１６、１７及び１８、１９及び２０、２１及び２２、２３及び２４、２５及び２６、２７及び２８、２９及び３０、３１及び３２、３３及び３４、並びに、３５及び３６のプライマーの対を用いてＰＣＲ法によって定量される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記肺細胞由来の細胞は肺胞マクロファージである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記肺胞マクロファージはマウスＭＨ－Ｓ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記内部標準遺伝子は、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β－アクチン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）からなる群から選択される、請求項５～９のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸入性化学物質を投与した培養細胞の遺伝子発現量に基づく吸入性化学物質の有害性予測方法に関し、具体的には吸入性無機化学物質を投与した不死化マウス肺胞マクロファージにおける遺伝子発現の増減パターンに基づく有害性予測方法に関する。
続きを表示（約 4,700 文字）【背景技術】
【０００２】
吸入性化学物質の有害性を評価することは労働者の作業現場では健康障害を発生させないためにも非常に重要である。吸入性化学物質の有害性は、これまで動物試験で評価が行われてきたが、高額であること、熟練が必要であること、判定までの期間がかかること、動物愛護の問題から、動物試験は限定して実施されるべきである。そのため、動物試験を実施する必要があるかを判断するには培養細胞を使った新しいスクリーニング試験が必要である。
【０００３】
吸入性化学物質のうち無機化学物質の不溶性粒子は呼吸器系に吸入されて気道粘膜又は肺胞に接着すると、再び気流に戻ることはない。この状態を沈着したという。気道、肺胞腔内に沈着した粒子状物質は粘膜線毛上皮系を主体とするクリアランス機構によって、その多くが排除される。肺胞領域はガス交換が行われる部位であるが、肺胞を構成するのは扁平のI型肺胞上皮細胞とその間に散在する立方型のII型肺胞上皮細胞であり、肺胞壁には貪食能を有する肺胞マクロファージが存在している。粒子径１μｍの微小粒子は肺胞に達するとされるが、多くは呼気により排出される。肺胞壁に沈着した粒子は肺胞マクロファージに貪食されて下気道領域へ輸送されるが、一部は間質を経てリンパ系に輸送される。
【０００４】
培養細胞を使って化学物質の有害性を評価した文献はいくつか既にある。例えば非特許文献１は、初代ヒト腎臓細胞を使った化学物質の腎臓毒性を予測する報告である。非特許文献２は、初代ラット胎児脳神経細胞を使った化学物質の発生毒性を予測する報告である。しかし、吸入性化学物質による肺毒性を肺由来の細胞を使って予測する報告はみあたらない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
ＲａｍｍＳ，ｅｔａｌ．ＴｏｘｉｃｏｌＳｃｉ．２０１９Ｍａｙ１；１６９（１）：５４－６９．
ＫｏｔａｋｅＹ第９５回日本薬理学会年会（２０２２年）講演要旨、1-S09-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、肺胞腔に到達した吸入性化学物質のクリアランスの主役である肺胞マクロファージのモデル実験系を使った吸入性化学物質の有害性を予測する方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、前記吸入性化学物質を投与された肺胞マクロファージのモデル実験系での遺伝子発現パターンに基づいて吸入性化学物質の有害性を予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、肺胞マクロファージのモデル実験系として不死化マウス肺胞マクロファージを使って、培養下で吸入性無機化学物質に曝露された肺胞不死化マウス肺胞マクロファージの遺伝子発現パターンを解析した。しかし、個々の吸入性無機化学物質ごとに遺伝子発現パターンは大きく異なる。そこで、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、有害な吸入性無機化学物質に共通して発現量が変化する遺伝子群（以下、「判別指標遺伝子群」と称する。）を特定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］
吸入性化学物質である試験物質の有害性の高低を予測する方法であって、
（１）試験物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから、試験物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量のリスト（Ｌ
Ｔ
）を得るステップと、
（２）前記Ｌ
Ｔ
と、陽性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量のリスト（Ｌ
ＰＣ
）及び陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量のリスト（Ｌ
ＮＣ
）とに基づく判別分析により、試験物質の有害性の高低を予測するステップとを含む群である、
方法。
［２］
前記判別指標遺伝子群は、Ａｈｃｙｌ１、Ａｓａｈ１、Ａｔｘｎ１０、Ｃｌｐｂ、Ｃｏｇ６、Ｃｒｏｔ、Ｃｕｔａ、Ｆａｍ１７３ａ、Ｆａｍ９６ａ、Ｎｕｓａｐ１、Ｏａｔ、Ｐｄｉａ６、Ｒｐｓ６ｋａ１、Ｒｓｌ１ｄ１、Ｓｃ５ｄ、Ｔｉｍｅｌｅｓｓ、Ｘｒｃｃ６及びＹａｒｓからなる、又は、を含む群である、［１］に記載の方法。
［３］
前記試験物質は吸入性無機化学物質である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記試験物質の有害性は肺障害性である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］
前記Ｌ
ＰＣ
は、
（ａ）陽性対照物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから得られた、前記陽性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量と、
（ｂ－１）前記陽性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における内部標準遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量、及び／又は
（ｂ－２）前記陽性対照物質の溶媒のみを投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量とから決定され、
前記Ｌ
ＮＣ
は、
（ｃ）陰性対照物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから得られた、前記陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量と、
（ｄ－１）前記陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における内部標準遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量、及び／又は
（ｄ－２）前記陰性対照物質の溶媒のみを投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量とから決定され、
前記Ｌ
Ｔ
は、
（ｅ）試験物質を肺細胞由来の細胞に投与し、前記肺細胞由来の細胞を培養後回収して得られたＲＮＡから得られた、前記試験物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量と、
（ｆ－１）前記試験物質を投与された肺細胞由来の細胞における内部標準遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量、及び／又は
（ｆ－２）前記試験物質の溶媒のみを投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの絶対発現量とから決定される、
［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
前記試験物質、陽性対照物質及び／又は陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、配列番号１及び／若しくは２、３及び／若しくは４、５及び／若しくは６、７及び／若しくは８、９及び／若しくは１０、１１及び／若しくは１２、１３及び／若しくは１４、１５及び／若しくは１６、１７及び／若しくは１８、１９及び／若しくは２０、２１及び／若しくは２２、２３及び／若しくは２４、２５及び／若しくは２６、２７及び／若しくは２８、２９及び／若しくは３０、３１及び／若しくは３２、３３及び／若しくは３４、並びに、３５及び／若しくは３６のヌクレオチド配列か、該ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列かを含む、若しくは、からなる、プライマーの対、プローブ又は１本鎖環状テンプレートを用いて定量される、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］
前記試験物質、陽性対照物質及び／又は陰性対照物質を投与された肺細胞由来の細胞における判別指標遺伝子群の各遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、配列番号１及び２、３及び４、５及び６、７及び８、９及び１０、１１及び１２、１３及び１４、１５及び１６、１７及び１８、１９及び２０、２１及び２２、２３及び２４、２５及び２６、２７及び２８、２９及び３０、３１及び３２、３３及び３４、並びに、３５及び３６のプライマーの対を用いてＰＣＲ法によって定量される、［６］に記載の方法。
［８］
前記肺細胞由来の細胞は肺胞マクロファージである、［１］～［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］
前記肺胞マクロファージはマウスＭＨ－Ｓ細胞である、［８］に記載の方法。
［１０］
前記内部標準遺伝子は、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β－アクチン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）からなる群から選択される、［５］～［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］
［１］～［１０］のいずれか１項に記載の方法に用いるための、配列番号１及び／若しくは２、３及び／若しくは４、５及び／若しくは６、７及び／若しくは８、９及び／若しくは１０、１１及び／若しくは１２、１３及び／若しくは１４、１５及び／若しくは１６、１７及び／若しくは１８、１９及び／若しくは２０、２１及び／若しくは２２、２３及び／若しくは２４、２５及び／若しくは２６、２７及び／若しくは２８、２９及び／若しくは３０、３１及び／若しくは３２、３３及び／若しくは３４、並びに、３５及び／若しくは３６のヌクレオチド配列か、該ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列かを含む、若しくは、からなる、プライマーの対、プローブ又は１本鎖環状テンプレート。
［１２］
［１］～［１０］のいずれか１項に記載の方法に用いるための、配列番号１及び／若しくは２、３及び／若しくは４、５及び／若しくは６、７及び／若しくは８、９及び／若しくは１０、１１及び／若しくは１２、１３及び／若しくは１４、１５及び／若しくは１６、１７及び／若しくは１８、１９及び／若しくは２０、２１及び／若しくは２２、２３及び／若しくは２４、２５及び／若しくは２６、２７及び／若しくは２８、２９及び／若しくは３０、３１及び／若しくは３２、３３及び／若しくは３４、並びに、３５及び／若しくは３６のヌクレオチド配列か、該ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列かを含む、若しくは、からなる、プライマーの対、プローブ又は１本鎖環状テンプレートを含む、キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、動物実験ではなく培養細胞を用いて吸入性無機化学物質である被験物質の肺障害性を予測する方法を提供することができる。また、本発明によれば、多数の被験物質の肺障害性を短時間で予測する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１－１ないし１－５は、表５の判別分析に用いた計算式を示す。
図２－１ないし２－４は、表８の判別分析に用いた計算式を示す。
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

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