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公開番号2025036075
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-03-14
出願番号2024078183
出願日2024-05-13
発明の名称抗原の検出方法
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類G01N 33/531 20060101AFI20250306BHJP(測定;試験)
要約【課題】単一ドメイン抗体を用いてウイルス等の抗原を高感度で検出可能な抗原検出方法を提供する。
【解決手段】単一ドメイン抗体を用いる抗原検出方法であって、2つ以上の単一ドメイン抗体がスペーサーを介して直列に連結された単一ドメイン抗体の多量体を捕捉抗体として用い、該スペーサーが8～30アミノ酸長のペプチドからなり、かつ2～8アミノ酸長からなる剛直性モチーフを含む、方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
単一ドメイン抗体を用いる抗原検出方法であって、２つ以上の単一ドメイン抗体がスペーサーを介して直列に連結された単一ドメイン抗体の多量体を捕捉抗体として用い、該スペーサーが８～３０アミノ酸長のペプチドからなり、かつ２～８アミノ酸長からなる剛直性モチーフを含む、方法。
続きを表示（約 1,200 文字）【請求項２】
前記スペーサーにおける剛直性モチーフの占める割合が３０％以上１００％以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
剛直性モチーフがヘリックス構造を形成するモチーフである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
剛直性モチーフのアミノ酸配列が（ＥＡＡＲ）
ｎ
〔ｎは３～７の整数を示す。〕、（ＥＡＡＫ）
ｎ
〔ｎは３～７の整数を示す。〕、（ＥＡＡＡＲ）
ｎ
〔ｎは２～６の整数を示す。〕、（ＥＡＡＡＫ）
ｎ
〔ｎは２～６の整数を示す。〕、（ＥＥＥＥＲＲＲＲ）
ｎ
〔ｎは２又は３の整数を示す。〕又は（ＥＥＥＥＫＫＫＫ）
ｎ
〔ｎは２又は３の整数を示す。〕である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
剛直性モチーフを構成するアミノ酸の５０％以上がＸＰ又はＰＸ〔Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。〕である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
剛直性モチーフのアミノ酸配列が（Ｐ）
ｌ
、（ＸＰ）
ｍ
、（ＰＸ）
ｎ
又はその組み合わせ〔ｌ、ｍ、ｎは独立して６～１５の整数を示し、Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。〕である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記スペーサーにおいて、剛直性モチーフ以外の部分のアミノ酸のグリシン含有率が５０％以上１００％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記スペーサーが剛直性モチーフ以外の部分のアミノ酸配列に、（Ｇ）
ｎ
、（ＧＸ）
ｎ
、（ＧＸ）
ｎ
、（ＧＧＸ）
ｎ
、（ＧＸＧ）
ｎ
、（ＸＧＧ）
ｎ
、（ＧＧＧＸ）
ｎ
、（ＧＧＸＧ）
ｎ
、（ＧＸＧＧ）
ｎ
、（ＸＧＧＧ）
ｎ
、（ＧＧＧＧＸ）
ｎ
、（ＧＧＧＸＧ）
ｎ
、（ＧＸＧＧＧ）
ｎ
、及び（ＸＧＧＧＧ）
ｎ
〔式中、ｎは１～５の整数を示し、Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。〕から選ばれる１種以上を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
単一ドメイン抗体の多量体が同一の抗原に対して結合活性を示す２種類以上の単一ドメイン抗体からなる、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
単一ドメイン抗体の多量体が２つ以上の同一の単一ドメイン抗体からなる、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一ドメイン抗体を用いた抗原の検出方法に関する。
続きを表示（約 2,400 文字）【背景技術】
【０００２】
ＶＨＨ（Ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｏｆｈｅａｖｙｃｈａｉｎｏｆｈｅａｖｙｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ）はラクダ科動物が有する重鎖抗体の可変部ドメインからのみなる単一ドメイン抗体である。その他の単一ドメイン抗体としては、サメが有する重鎖抗体の可変ドメインであるＶＮＡＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｏｆｎｅｗａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）等が含まれる。また、ＶＨＨやＶＮＡＲのアミノ酸配列情報をもとに人工的に改変が加えられたアミノ酸配列からなる可変ドメインも、単一ドメイン抗体に含まれる。
【０００３】
ＶＨＨはＩｇＧ抗体と同等の結合活性を示しながらも、（１）ＩｇＧ抗体と比較して分子量が１０分の１程度であり、従来の抗体では結合できない新規のエピトープが期待されること、（２）ＩｇＧ抗体とは異なり、可逆性の高いタンパク質構造をもち、熱や圧に対して優れた耐性を示すこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、酵母や細菌等の微生物を用いた生産が可能であること、等の特徴をもつ。さらに、（４）ＶＨＨは、ｃＤＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法等の試験管内の抗体選抜技術との親和性が非常に高く、マウスやウサギ等への免疫によって得られるＩｇＧ抗体と比較して、より短期間に開発することが可能である。そのため、ＶＨＨは医薬品や検査薬に用いられてきたＩｇＧ抗体やＩｇＡ抗体といった従来の免疫グロブリンに代わる抗体としてその利用が期待されている。
【０００４】
近年のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ２）により引き起こされる新型コロナウイルス感染症の世界的流行を受けて、ＰＯＣＴ（ＰｏｉｎｔｏｆＣａｒｅＴｅｓｔｉｎｇ）の必要性が以前にも増して高まっている背景がある。
【０００５】
代表的なＰＯＣＴとして、イムノクロマト法を原理とした抗原検査キットが挙げられる。イムノクロマト法では、予め用意された金コロイドやラテックス粒子等と結合した抗体（以下、標識抗体と呼ぶ）と被検体中に含まれる抗原が複合体を形成しながら毛細管現象によりニトロセルロース膜上を移動し、予めニトロセルロース膜上に固相化された抗体（以下、捕捉抗体と呼ぶ）が抗原-標識抗体複合体と結合することで呈色することを利用した免疫測定法である。現在、市販されているイムノクロマトキットの殆どはマウスやウサギ等に由来するモノクローナル、又はポリクローナルＩｇＧ抗体が用いられている。
【０００６】
検査薬の開発においても、ＶＨＨの優位性は明らかである。特に、ＶＨＨが有する特性から、（１）ＶＨＨは粒子やニトロセルロース膜に高密度に固相化することが可能であり、より多くのパラトープを基材上に提示することができること、（２）ＶＨＨはタンパク質としての安定性に優れており、製品のより優れた保存安定性が期待できること、（３）ＶＨＨは微生物によって大量かつ安価に生産可能であるため、製造原価をより低減させることが出来ること、（４）ＶＨＨはイムノクロマト法において非特異的反応の原因となりうるＦｃ領域を有さないこと、がＩｇＧ抗体と比較して優位であると考えられる。
【０００７】
しかしながら、イムノクロマト法等の抗原検査法にＶＨＨを用いることには課題がある。可変領域のみからなるＶＨＨは、（１）ＩｇＧ抗体と比較して低分子量であるため、基材への物理的な吸着性能が低いこと、（２）基材への固相化時に受けるタンパク質変性効果により、結合活性が低下しやすいこと、（３）ＩｇＧ抗体とは異なり、ＶＨＨはＦｃ領域を持たないため、基材へのランダムな吸着において配向性の制御が困難であること、が知られている。このような理由から、ＶＨＨを捕捉抗体として用いた場合、結合活性が低下しやすいことが課題となる。すなわち、イムノクロマト法において、ＶＨＨを捕捉抗体として用いた場合、高感度に抗原を検出することが難しいこと知られている。
【０００８】
この課題に対して、非特許文献１ではコンジュゲーションパッドに予め用意された標識抗体としてのＶＨＨとビオチン標識化されたＶＨＨの２種類の抗体、そしてニトロセルロース膜上にはビオチンに対して結合活性を示すストレプトアビジンを固相化する方法が用いられている。すなわち、ニトロセルロース膜上で、標識抗体―抗原―ビオチン化ＶＨＨの複合体を形成させ、その複合体をストレプトアビジンにより捕捉する方法である（従来技術１）。
【０００９】
また、非特許文献２では標識抗体にＶＨＨを用いており、捕捉抗体としては予め用意されたビオチン化ＶＨＨ―ストレプトアビジン複合体をニトロセルロース膜上に固相化する方法が用いられている。すなわち、ニトロセルロース膜におけるＶＨＨの固相化をストレプトアビジンとニトロセルロース膜間の相互作用に依存させる方法である（従来技術２）。
【００１０】
また、非特許文献３ではＩｇＧ抗体が抗原を認識するための最小単位であるＶＨとＶＬから構成される可変領域をペプチドスペーサーで結合した単鎖可変領域フラグメントを、セルロース膜を用いたイムノクロマト法における捕捉抗体として用いている。単鎖可変領域フラグメントを捕捉抗体として用いた場合では検出感度に課題があるが、セルロース膜に対して結合する炭水化物結合モジュールを用いることで解決している（従来技術３）。すなわち、単鎖可変領域フラグメントと炭水化物結合モジュールを連結することにより、セルロース膜上の当該単鎖可変領域フラグメントの固定化量及び配向性が制御され、捕捉抗体として用いられた単鎖可変領域フラグメントの結合活性を向上させたことを報告している。
（【００１１】以降は省略されています）

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