特許ウォッチ

公開番号2025026213
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-02-21
出願番号2023131672
出願日2023-08-10
発明の名称肝臓における遺伝子発現を増強する核酸エレメント及びその用途
出願人学校法人自治医科大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 15/113 20100101AFI20250214BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】安全性と治療効果とを両立した、血友病やオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症をはじめとする肝臓を標的とする遺伝子治療手段を提供すること。
【解決手段】セレノプロテインP(SELENOP)遺伝子のイントロン1の全長又はスプライシングドナー及びアクセプター配列を含むその部分配列を含んでなる、肝臓細胞における遺伝子発現を増強するための、単離された核酸エレメント;肝臓細胞で機能的なプロモーターの下流に該核酸エレメントが結合した合成プロモーター;該合成プロモーターを含む肝臓における遺伝子発現用の発現ベクター;該ベクターを含む遺伝子治療剤;該発現ベクター又は遺伝子治療剤を低用量で投与することを特徴とする遺伝子治療方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
セレノプロテインP（SELENOP）遺伝子のイントロン1の全長又はスプライシングドナー及びアクセプター配列を含むその部分配列を含んでなる、肝臓細胞における遺伝子発現を増強するための、単離された核酸エレメント。
続きを表示（約 720 文字）【請求項２】
前記イントロンの全長が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列又はそのバリアント配列からなる、請求項１に記載の核酸エレメント。
【請求項３】
前記部分配列が、全体として５０ヌクレオチド長以上である、請求項１又は２に記載の核酸エレメント。
【請求項４】
肝臓細胞で機能的なプロモーターの下流に、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸エレメントが結合してなる、合成プロモーター。
【請求項５】
肝臓細胞で機能的なプロモーターが、トランスサイレチン（TTR）プロモーター、α1-アンチトリプシン（AAT）プロモーター、及びヒトAATプロモーターとApo E/C1遺伝子の肝臓型制御領域（HCR）とのキメラプロモーター（HCRhAAT）から選択される、請求項４に記載の合成プロモーター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の合成プロモーターを含む、肝臓細胞における遺伝子発現のための発現ベクター。
【請求項７】
合成プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする核酸を含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
目的タンパク質が治療タンパク質である、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
治療タンパク質が、第VIII凝固因子、第IX凝固因子又はオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）である、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
ウイルスベクター又はプラスミドベクターである、請求項７～９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓における遺伝子発現を増強する核酸エレメント、該エレメントを含む肝臓で高発現する合成プロモーター、並びに該プロモーターを含む肝臓発現用ベクター（例、アデノ随伴ウイルス（AAV）等のウイルスベクター）、該ベクターを用いた遺伝子治療等に関する。
続きを表示（約 6,000 文字）【背景技術】
【０００２】
近年、AAVベクターを利用した遺伝子治療薬の開発が活発になっている。AAVベクターは静止期の細胞にも効率的に遺伝子導入が可能なこと、安全性が他のベクターよりも高いことから、現在最も用いられているウイルスベクターである。主なAAVベクターの標的とする臓器の１つは肝臓である。肝臓はAAVベクターの静脈投与で高効率に遺伝子導入が可能である。肝臓を標的とした遺伝子治療は、凝固因子欠乏症である血友病、尿素代謝異常であるオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）欠損症など多くの疾患が対象となる。
【０００３】
ところが、最近になって、これまで非病原性で安全性が高いと信じられていたAAVベクターにおいても、臨床試験において高用量を血管から全身投与された患者について、重篤な有害事象、特に重篤な肝障害による死亡例が報告された。そのため、ベクターの種類に関係なく、高用量のベクターの全身投与は、肝障害を含む重大な有害事象を引き起こす可能性があり、より低用量で治療遺伝子を高発現し得る発現ベクターの開発が求められている。
【０００４】
現在、肝臓での高発現を指向するAAVベクターには、恒常的な高発現プロモーターであるCAGプロモーターや、トランスサイレチン（TTR）（例えば、非特許文献１参照）やα1アンチトリプシン（AAT）等の肝臓特異的遺伝子のプロモーターが用いられている。特に、ヒトAATプロモーターの上流にApo E/C1遺伝子の肝臓型制御領域（HCR）エンハンサーを連結したキメラプロモーターHCCRhAATがよく用いられている（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
N Engl J Med. 2021 Nov 18;385(21):1961-1973. doi: 10.1056/NEJMoa2104205.
N Engl J Med. 2022 Jul 21;387(3):237-247. doi: 10.1056/NEJMoa2119913.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既存の肝臓特異的プロモーターは、安全性と治療効果との両立を考慮すると必ずしも十分とはいえない。従って、本発明の目的は、低用量のベクター投与でも、所望の治療効果を奏するのに十分な量の遺伝子発現を実現する新規な遺伝子発現増強核酸エレメントを同定し、以って、安全性と治療効果とを両立し得る、新規な肝臓を標的とする遺伝子治療手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成すべく、本発明者らはまず、既報のプロテオーム解析データ（Cell Proteomics 2016 Oct;15(10):3190-3202. doi: 10.1074/mcp.M116.060145.）から肝臓で発現が高い遺伝子を選び出し、プロモーター解析を行った。その過程で、偶然、セレノプロテインP（SELENOP）遺伝子の第1イントロン配列の僅かな挿入がプロモーター活性に影響することを見出した。そこで、該第1イントロン（「イントロン1」という場合がある）の全長をクローニングし、また種々の長さの短縮化したフラグメントを作製し、既報の肝臓特異的プロモーターに連結して、それらの肝における遺伝子発現増強効果をインビトロ及びインビボで解析した。その結果、SELENOPイントロン1の全長及び種々のフラグメントは、いずれの肝発現プロモーターについても、その遺伝子発現効率を著明に増強し得ることがわかった。スプライシングドナー及びアクセプター配列を除去すると効果が消失したことから、該イントロンは、スプライシングを介して遺伝子発現増強効果を発揮することが明らかとなった。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［項１］
セレノプロテインP（SELENOP）遺伝子のイントロン1の全長又はスプライシングドナー及びアクセプター配列を含むその部分配列を含んでなる、肝臓細胞における遺伝子発現を増強するための、単離された核酸エレメント。
［項２］
前記イントロンの全長が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列又はそのバリアント配列からなる、項１に記載の核酸エレメント。
［項３」
前記部分配列が、全体として５０ヌクレオチド長以上である、項１又は２に記載の核酸エレメント。
［項４］
肝臓細胞で機能的なプロモーターの下流に、項１～３のいずれか一項に記載の核酸エレメントが結合してなる、合成プロモーター。
［項５］
肝臓細胞で機能的なプロモーターが、トランスサイレチン（TTR）プロモーター、α1-アンチトリプシン（AAT）プロモーター、及びヒトAATプロモーターとApo E/C1遺伝子の肝臓型制御領域（HCR）とのキメラプロモーター（HCRhAAT）から選択される、項４に記載の合成プロモーター。
［項６］
項４又は５に記載の合成プロモーターを含む、肝臓細胞における遺伝子発現のための発現ベクター。
［項７］
合成プロモーターの下流に目的タンパク質をコードする核酸を含む、項６に記載の発現ベクター。
［項８］
目的タンパク質が治療タンパク質である、項７に記載の発現ベクター。
［項９］
治療タンパク質が、第VIII凝固因子、第IX凝固因子又はオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）である、項８に記載の発現ベクター。
［項１０］
ウイルスベクター又はプラスミドベクターである、項７～９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
［項１１］
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、センダイウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、項１０に記載の発現ベクター。
［項１２］
項８～１１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含んでなる、遺伝子治療剤。
［項１３］
項７～１１のいずれか一項に記載の発現ベクター又は項１２に記載の遺伝子治療剤を、インビトロで肝臓細胞に導入することを含む、肝臓細胞において目的タンパク質を発現させる方法。
［項１４］
治療上有効な量の、項８～１１のいずれか一項に記載の発現ベクター又は項１２に記載の遺伝子治療剤を、肝臓細胞における治療タンパク質の発現を必要とする対象に投与することを含む、該対象における該タンパク質の欠損に起因する疾患の治療方法。
［項１５］
治療上有効な量が、肝臓細胞で機能的なプロモーターのみの下流に治療タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターにおける治療上有効な量よりも低用量である、項１４に記載の方法。
［項１６］
対象がヒトである、項１４又は１５に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、低用量のベクター投与であっても、肝臓における十分な遺伝子発現を達成し得るので、高用量投与による有害事象のリスクを回避し安全性を担保した上で、血友病やOTC欠損症をはじめとする、肝臓での治療遺伝子の発現が必要な疾患に対するインビボ遺伝子治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図１は、SELENOPイントロン1がインビトロで肝細胞における導入遺伝子の発現を増強することを示す。（Ａ）本研究に用いたイントロン配列の模式図。示されたイントロン配列（SELENOP (1), SELENOP (2), SELENOP (3), SELENOP (full), SERPINA1 (1), SERPINA1 (2), SERPINA1 (3), SERPINA1 (full)又はF9 (FIX)イントロン）は、プラスミドのHCRhAAT（Apo E/C1遺伝子の肝臓型制御領域エンハンサー及びヒトアンチトリプシン）プロモーターの直後に挿入された。（Ｂ，Ｃ）HEK293細胞（Ｂ）又はHuh-7細胞（Ｃ）に示されたプロモーターにより駆動されるプラスミドを導入した。細胞溶解液中のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定し、相対的光ユニットで表した。数値は平均±SDで示す（n=3）。統計学的有意差は、ダネットの多重比較事後検定を伴う一元配置分散分析（HCRhAATとの比較）により検定した。ns: 有意差なし; ****: P<0.0001
図２は、SELENOPイントロン1がインビトロで肝細胞におけるAAVベクターによる導入遺伝子の発現を増強することを示す。（Ａ）AAVベクターの模式図。HCRhAAT又はCAGプロモーターにより駆動され、ルシフェラーゼを発現する。示されたイントロン配列（SELENOP (1), SELENOP (2), SELENOP (3), SERPINA1 (1), SERPINA1 (2), SERPINA1 (3)又はF9 (FIX)イントロン）は、HCRhAATプロモーターの直後に挿入された。（Ｂ，Ｃ，Ｄ）Huh-7細胞（Ｂ）、HEL293細胞（Ｃ）又はヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）（Ｄ）に示されたAAV6ベクターを感染多重度（MOI）1×10
4
ベクターゲノムで導入した。細胞溶解液中のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定し、相対的光ユニットで表した。数値は平均±SDで示す（n=3）。統計学的有意差は、ダネットの多重比較事後検定を伴う一元配置分散分析（HCRhAATとの比較）により検定した。ns: 有意差なし; *: P<0.05; ****: P<0.0001
図３は、SELENOPイントロン1による導入遺伝子の発現増強はスプライシングを必要とすることを示す。ルシフェラーゼを担持する示されたAAV6ベクターを、感染多重度（MOI）1×10
4
ベクターゲノムでHuh-7細胞に導入した。AAVベクターの模式図を左パネルに示す。細胞溶解液中のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定し、相対的光ユニットで表した。数値は平均±SDで示す（n=3）。（Ａ）HCRhAATプロモーター又はSELENOPイントロン1により駆動されるルシフェラーゼ発現の比較。（Ｂ）SELENOPイントロン1をHCRhAAT（insertion 5’）又はSV40 polyA（insertion ３’）の下流に挿入した。（Ｃ）SELENOPイントロン1のスプライスドナー及びスプライスアクセプターの存在下及び非存在下でのルシフェラーゼ発現の比較。統計学的有意差は、スチューデントの両側検定（2群間の比較）又はダネットの多重比較事後検定を伴う一元配置分散分析（HCRhAATとの比較）により検定した。ns: 有意差なし; ***: P<0.001; ****: P<0.0001
図４は、SELENOPイントロン1がインビボでの肝臓におけるAAVベクターによる導入遺伝子の発現を増強することを示す。（Ａ）AAVベクターの模式図。（Ｂ，Ｃ，Ｄ）C57BL/6マウスをヒトF9（第IX凝固因子（FIX））cDNAを担持するAAV8ベクターで処理した。（Ｂ）血漿中のFIX抗原（FIX:Ag）の増加。（Ｃ）定量的RT-PCRにより評価した肝臓におけるF9 mRNA発現。（Ｄ）肝臓中のAAVゲノム量を定量的PCRにより評価した。（Ｅ，Ｆ，Ｇ）ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）cDNAをコンジュゲートしたFLAG配列を担持するAAV8ベクターでC57BL/6マウスを処理した。（Ｅ）イムノブロッティング（左）及び定量的データ（右）により肝臓におけるOTC発現を評価した。（Ｆ）定量的RT-PCRにより評価した肝臓におけるOTC mRNA発現。（Ｇ）定量的PCRにより評価した肝臓におけるAAVゲノム量。数値は平均±SDで示す（n=3）。統計学的有意差は、スチューデントの両側検定（2群間の比較）又はシダックの多重比較事後検定を伴う二元配置分散分析により検定した。ns: 有意差なし; ***: P<0.001; ****: P<0.0001
図５は、SELENOPイントロン1がマウストランスサイレチンプロモーターにより駆動される導入遺伝子の発現を増強することを示す。（Ａ）AAVベクターの模式図。示されたイントロン配列（マウス最小ウイルスイントロン（MVMi）, SELENOP (1), SELENOP (2)又はSELENOP (3)）を含む、又は含まないマウストランスサイレチン（mTTRp）により駆動され、ルシフェラーゼを発現する。（Ｂ）Huh-7細胞に、示されたAAV6ベクターを感染多重度（MOI）1×10
4
vgで導入した。細胞溶解液中のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定し、相対的光ユニットで表した。数値は平均±SDで示す（n=3）。統計学的解析はダネットの多重比較事後検定を伴う一元配置分散分析により行った（mTTRとの比較）。***: P<0.001（Ｃ，Ｄ）mTTRp又はSELENOP (3)イントロンをコンジュゲートしたmTTRpにより駆動されるルシフェラーゼを担持するAAV8ベクター（1×10
10
ベクターゲノム）で、C57BL/6マウスを処理した。（Ｃ）ベクター投与から4週間後のIVISイメージングシステムの代表的データ。（Ｄ）光子ユニット（光子／秒）で表した定量的データ。数値は平均±SDで示す（n=4）。統計学的解析はスチューデントの両側検定により行った。P<0.001; ****: P<0.0001
【発明を実施するための形態】
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許