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公開番号2025004104
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-01-14
出願番号2024174157,2021513392
出願日2024-10-03,2019-09-12
発明の名称造血幹細胞およびその派生体の生成のためのオルガノイド組成物
出願人チルドレンズホスピタルメディカルセンター
代理人個人
主分類C12N 5/0789 20100101AFI20250106BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】造血幹細胞(HSC)または派生免疫細胞を作製する方法を提供する。
【解決手段】方法は、a.前駆細胞から派生される胚体内胚葉を、wntシグナル伝達経路アクチベーターおよびFGFシグナル伝達経路アクチベーターと、前腸細胞が形成されるまで接触させることと、b.前記前腸細胞をレチノイン酸の非存在下で培養して、造血細胞を生成する肝臓オルガノイドを形成することと、を含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
造血幹細胞（ＨＳＣ）またはその派生細胞を作製する方法であって、
ａ．前駆細胞から派生される胚体内胚葉を、ｗｎｔシグナル伝達経路アクチベーターおよびＦＧＦシグナル伝達経路アクチベーターと、前腸細胞が形成されるまで接触させることと、
ｂ．前記前腸細胞をレチノイン酸の非存在下で培養して、造血細胞を生成する肝臓オルガノイドを形成することと、を含む、方法。
続きを表示（約 2,000 文字）【請求項２】
前記前駆細胞は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の一方または両方から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｗｎｔシグナル伝達経路アクチベーターは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、前記ｗｎｔシグナル伝達経路の小分子アクチベーター（例えば、塩化リチウム、２－アミノ－４，６－二置換ピリミジン（ヘテロ）アリールピリミジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＮＳＣ６６８０３６、ＤＣＡβ－カテニン、２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）－ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジン）、ＷＡＹ－３１６６０６、ＳＢ－２１６７６３、またはＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム））、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路のｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡアクチベーター、ＧＳＫ３阻害剤（例えば、カイロン／ＣＨＩＲ９９０２）、ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦシグナル伝達経路アクチベーターは、小分子またはタンパク質ＦＧＦシグナル伝達経路アクチベーター、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、前記ＦＧＦシグナル伝達経路のｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡアクチベーター、ならびにそれらの組み合わせから選択される、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記前腸細胞は、前記肝臓オルガノイドを形成する前にスフェロイドを形成する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記前腸細胞は、前記肝臓オルガノイドを形成する前にスフェロイドを形成し、前記方法は、前記スフェロイドを断片化して複数の細胞を形成することをさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記断片化は、化学的破壊および機械的破壊の一方または両方を介して実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記断片化は酵素による処理を含み、好ましくは、前記酵素はタンパク質分解酵素活性およびコラーゲン分解酵素活性の一方または両方を有する酵素、好ましくは、Ａｃｃｕｔａｓｅ、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、パパイン、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｓｉｇｍａ製）、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の酵素である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記前腸は、トランスフェリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびそれらの組み合わせから選択されるサイトカインの存在下で培養され、好ましくは、前記前腸は前記培養の前に単一細胞に解離され、サイトカインを伴う前記培養は、約１日、または約２日、または約３日、または約４日、または約５日、または約６日、または約７日、または約８日、または約９日、または約１０日、または約１１日、または約１２日、または約１３日、または約１４日、または約１５日、または約１６日、または約１７日、または約１８日、または約１９日、または約２０日、または約２１日、または約３週、または約４週、または約５週、または約６週、または約７週、または約８週、または約９週、または約１０週、または約１１週、または約１２週、または１２週超の間実行される、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト肝臓オルガノイドをトロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）の一方または両方と接触させることをさらに含み、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）の一方または両方と接触させることは、約１日、または約２日、または約３日、または約４日、または約５日、または約６日、または約７日、または約８日、または約９日、または約１０日、または約１１日、または約１２日、または約１３日、または約１４日、または約１５日、または約１６日、または約１７日、または約１８日、または約１９日、または約２０日、または約２１日、または約３週、または約４週、または約５週、または約６週、または約７週、または約８週、または約９週、または約１０週、または約１１週、または約１２週、または１２週超の間実行される、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年９月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／７３０，０６１号の優先権および利益を主張し、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
続きを表示（約 4,500 文字）【背景技術】
【０００２】
現在、造血系の再構成を必要とする個体では、骨髄移植が主要な治療の手段である。提供された骨髄における幹細胞および前駆細胞は、防御免疫、組織修復、凝固、およびその他の血液の機能に関与する血球を増殖させ、置き換えることができる。骨髄移植が成功すると、血液、骨髄、脾臓、胸腺、および免疫の他の器官は、ドナーから派生される細胞によって再配置され得る。骨髄は、様々な疾患に高い成功率で使用されており、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、免疫不全、リンパ腫または白血病などの癌、癌腫、様々な固形腫瘍、および造血の遺伝性疾患などが含まれる。骨髄移植はまた、遺伝性蓄積症、重症型サラセミア、鎌状赤血球症、および骨粗鬆症の治療に適用されている。
【０００３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、あらゆるタイプの血球に分化する能力があり、移植して血液疾患を治療することができるが、ドナー不足のため、ＨＳＣを大量に得ることは困難である。さらに、完全に一致する（遺伝的に同一の）ドナーはまれであり、免疫細胞を得るための骨髄移植を、それを必要とする個体に使用することは、厳しく制限される。
【０００４】
したがって、当技術分野では、移植に適したＨＳＣ組成物、およびＨＳＣを提供することができる方法が依然として必要とされている。さらに、そのような組成物の開発は、最新のＨＳＣを十分な量で利用できない研究目的のために有用であろう。本開示は、当技術分野における前述のニーズの１つ以上に対処しようとする。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または派生免疫細胞の製造のための、前駆細胞から派生される組成物、およびそのような組成物を使用する方法に関する。より具体的には、オルガノイド組織またはオルガノイドを含む培養物から造血幹細胞を得るための方法が開示され、オルガノイド組織または培養物は、分化誘導を介して、前駆細胞（胚性幹細胞または人工多能性幹細胞など）から派生される肝臓または結腸組織を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
当業者は、以下に記載される図面が例示のみを目的としていることを理解するであろう。図面は、いかなる方法でも本教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０００７】
ヒト肝臓オルガノイド（ＨＬＯ）遺伝子発現の培養２１日目における特性。Ａ．成熟肝臓オルガノイドを分化させる以前の方法と比較して、アルブミン発現は中程度減少し、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）発現は増加する（Ｏｕｃｈｉら、２０１９）。Ｂ．内皮マーカーＣＤ３４およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）は増加する。Ｃ．エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびヘモグロビンγ（ＨＢＧ）の両方が増加する。
ＨＬＯ培養からの骨髄系統の分化。Ａ．ＨＬＯ培養を８～２０日目に単一細胞懸濁液に分離し、サイトカインを添加したメチルセルロースに加えて骨髄分化を促進させ、７～１４日後にコロニーを分析した。Ｂ．生成された複数の細胞タイプを示す代表的なギムザ染色。Ｃ．ＨＬＯ培養からの細胞を臍帯血（ＵＣＢ）ＣＤ３４
＋
細胞および未分化ｉＰＳＣと比較するＣＦＣコロニーの定量化（Ｎ．Ｄ．＝検出不能）。
ＨＬＯ培養からのＢ細胞の分化。Ａ．ＨＬＯ培養物は、８～２０日目に単一細胞懸濁液に分離し、コンフルエントなＭＳ－５細胞と共培養した。Ｂ．ＭＳ－５との共培養後のＵＣＢＣＤ３４
＋
細胞およびＨＬＯのフローサイトメトリー。細胞は最初にＣＤ４５でゲーティングし、次にＣＤ１９およびＣＤ１１ｂでゲーティングし、それぞれＢ細胞および骨髄細胞を分離した。
造血内皮細胞は、ヒト結腸オルガノイド培養で共発生する。（Ａ）背側大動脈におけるｅ１０．５マウス胚核ＲＵＮＸ１染色の全組織標本のＲＵＮＸ１（赤）、ＥＮＤＯＭＵＣＩＮ（緑）、およびＣＤＸ２（白）染色（ｎ＝３）。（Ｂ、Ｃ）（Ａ）の光学的スライス。（Ｄ）ＣＤ３４＋内皮管内の核ＲＵＮＸ１染色を示す２２日目のＨＣＯの全組織標本ＲＵＮＸ１（赤）、ＣＤ３４（緑）およびＣＤＨ１（白）染色（ｎ＝３）。（Ｅ、Ｆ）（Ｄ）からの光学的スライス。ＤＡ＝背側大動脈。（Ｇ）２１日目のＨＩＯおよびＨＣＯから得られるＲＮＡｓｅｑデータのＴＰＭ（百万個当たりの転写値）のグラフ（各グループでｎ＝３）。（Ｈ）ゲーティングしたＣＤ３４＋細胞のＣＤ４５およびＣＤ７３で染色したフローサイトメトリープロット。ＣＤ３４＋／ＣＤ４５－／ＣＤ７３－細胞は黒色枠で囲まれている。ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ７３－細胞は緑色枠で囲まれている。
赤血球－骨髄およびリンパの前駆細胞は、ＨＣＯ培養で生成される。（Ａ）ＨＣＯ培養物からサイトスピンした細胞の顕微鏡写真。（Ｂ）Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標）培地で形成されたコロニーの例。（Ｃ）Ｈ１ヒト胚性幹細胞および（Ｄ）ＩＰＳＣ２６３－１０から派生されるＨＣＯ細胞からの細胞のＭｅｔｈｏｃｕｌｔ（商標）におけるコロニー形成の定量化。（Ｅ）ＣＤ３およびＣＤ４で染色された、サイトカインを誘導するＴ細胞分化によって処理または未処理のＣＤ４５ゲーティング細胞のフローサイトメトリープロット。
ＨＣＯは共発生したマクロファージを含む。（Ａ）ＤＡＰＩで対比染色したＣＤ１６３（赤）およびＣＤＨ１（緑）におけるヒト結腸生検の免疫蛍光染色。（Ａ’）（Ａ）の枠領域の挿入図。ＤＡＰＩで対比染色したＣＤ１６３（赤）およびＣＤＨ１（緑）について染色した（Ｂ）ＨＩＯおよび（Ｃ）ＨＣＯの全組織標本。３５日目のＨＩＯおよびＨＣＯから得られたＲＮＡｓｅｑデータからの（Ｄ）ＳＰＩ１（ＰＵ．１）および（Ｅ）ＣＤ１６３のＴＰＭ（百万個あたりの転写値）のグラフ（各群についてｎ＝３）。ＤＡＰＩで対比染色されｈＣＤ１６３（赤）およびＦ４／８０（緑）について染色された（Ｆ）マウス結腸、（Ｇ）ヒト結腸生検および移植ＨＣＯの免疫蛍光染色。
ＨＣＯは炎症促進性サイトカインを分泌する炎症性マクロファージを有する。（Ａ）３５ｄＨＩＯおよびＨＣＯのＲＮＡｓｅｑデータから作成された炎症関連遺伝子のヒートマップ。（Ｂ）ＤＡＰＩで対比染色したＣＤ１６３（緑）、ｉＮＯＳ（赤）、およびＣＤＨ１（白）における３５日目のＨＣＯの免疫蛍光染色。（Ｂ’）Ｂの枠領域の挿入図で、ＤＡＰＩを除く。（Ｃ～Ｄ）ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ１Ａ（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ１Ｂ（ＣＣＬ４）におけるＬｕｍｉｎｅｘアレイデータ。各ポイントは、個々の分化からのＬｕｍｉｎｅｘ値を表す。ペア化したＨＩＯ試料およびＨＣＯ試料（同じ分化から）は線で示される。
ＨＣＯマクロファージは機能的である。（Ａ）ＬＰＳで処理されたＨＣＯのライブイメージングの時間経過の顕微鏡写真。（Ｂ～Ｅ）ＨＣＯまたはＬＰＳで処理されたＨＣＯのＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＩＰ１Ａ（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ１Ｂ（ＣＣＬ４）に関するＬｕｍｉｎｅｘアレイデータ。（Ｆ）－／＋ｐＨＲＯＤＯＥ．ｃｏｌｉ粒子（緑）およびＣＤ１４（赤）における３５日目のＨＣＯの免疫蛍光染色。（Ｇ）貪食された粒子の定量（緑）（群あたりオルガノイドのウェルｎ＝３）。
ＨＣＯｍａｃは細菌に反応してオルガノイド内腔に移動する。（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）共生Ｅ．ｃｏｌｉ、および（Ｃ）ＥＨＥＣの注入２４時間後にＤＡＰＩで対比染色したＣＤＨ１（緑）およびＭＵＣ２（赤）についての３５日目のＨＣＯの免疫蛍光染色。（Ｄ）ＰＢＳ、（Ｅ）共生Ｅ．ｃｏｌｉ、および（Ｆ）ＥＨＥＣの注入２４時間後にＤＡＰＩで対比染色したＣＤＨ１（緑）、ＨＡＭ５６（赤）、およびＥ．ｃｏｌｉ（白）についての３５日目のＨＣＯの免疫蛍光染色。（Ｇ）ＭＵＣ２蛍光強度の定量化（群あたりｎ＝３）。（Ｈ）Ｅ．ｃｏｌｉ蛍光強度の定量化（群あたりｎ＝３）。（Ｉ）ＨＡＭ５６マクロファージ分布の定量化（群あたりｎ＝３オルガノイド）。
実験ワークフロー。
ＢＭＰシグナル伝達は、造血内皮細胞を特定する。
ＨＣＯ培養内で内皮細胞および造血細胞が共発生する。
ＨＣＯ培養から派生される赤血球におけるヘモグロビン発現。
ＨＣＯに存在する免疫細胞のＣｙｔｏｆ分析。
ＷＥＬＬＳ図Ｓ６。マクロファージは、マウス腎被膜への移植後にＨＣＯ内に存続する。
ＷＥＬＬＳ図Ｓ７。遺伝子オントロジー分析は、ＨＣＯにおける並行した細胞分化、マクロファージ成熟、および炎症を明らかにする。
ＨＣＯ内のマクロファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ粒子に反応して糸状仮足を伸長することができる。
胎盤、肝臓、肺、および結腸の画像。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
特に断りのない限り、用語は、関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。矛盾する場合は、定義を含む本文書が優先される。好ましい方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【０００９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「および」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者などに知られている１つ以上の用量およびその均等物への言及を含む。
【００１０】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的な系またはプロセスに関して、本用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載される場合、特記しない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
（【００１１】以降は省略されています）

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