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公開番号2024164042
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-26
出願番号2024127869,2021516863
出願日2024-08-02,2019-06-03
発明の名称タンパク質と細胞のグリカン分析
出願人エムユーエスシーファウンデーションフォーリサーチディベロップメント,バンアンデルリサーチインスティテュート
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類G01N 27/62 20210101AFI20241119BHJP(測定;試験)
要約【課題】本発明は、生体試料中のタンパク質及び細胞を含む複合溶液中のグリカン分析のための方法及び組成物を提供する。
【解決手段】前記方法は、多重分析用にタンパク質及び細胞を捕捉するための基板の調製を含む。細胞及びタンパク質は、抗体アレイ、培養、又は直接沈着によって捕捉され得る。本発明はさらに、病状及び疾患進行の診断及びスクリーニングにおけるタンパク質及び細胞グリカン分析の使用に関する。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
少なくとも１つの試料のグリカン分析ための方法であって、
複数の抗体がスポットされた表面を有する基板を提供する工程、
ブロッキング溶液中で前記基板をインキュベートする工程、
少なくとも１つの試料で前記基板をインキュベートする工程、
前記基板に酵素放出溶液を噴霧する工程、及び
質量分析によって前記基板をスキャンして、グリカンの存在を検出及び識別する工程、
を含む、方法。
続きを表示（約 620 文字）【請求項２】
前記少なくとも１つの試料が、少なくとも１つのタンパク質溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの試料が、少なくとも１つの細胞集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの細胞集団が、前記基板に酵素放出溶液を噴霧する工程の前に、固定剤及びリンス剤中でインキュベートされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記固定及びリンス剤が、ホルマリン、カルノア液、パラホルムアルデヒド、エタノール系固定剤、及びポリエチレングリコール系固定剤からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記基板がガラス又はプラスチックの顕微鏡スライド又はマルチウェルプレートである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロッキング溶液が血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血清が、ＰＢＳ及び洗浄剤中の１％ＢＳＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ブロッキング溶液が、３×ＰＢＳ浴及び１×水浴を含む洗浄工程で除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの試料が、湿度チャンバー内で室温で２時間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年６月１日に出願された米国特許仮出願第６２／６７９，２０２号明細書の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
続きを表示（約 2,700 文字）【０００２】
連邦政府が後援する研究又は開発に関する声明
本発明は、米国国立がん研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＮＣＩ）によって提供された助成金番号Ｒ２１ＣＡ２２５４７４の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細胞表面及び分泌タンパク質のＮ－結合型グリコシル化の変化は、多くの癌で発生することが知られている。実際に、これらのグリカンはしばしば癌細胞とその環境との間の相互作用を媒介する。現在使用されている癌のバイオマーカーのほとんどは、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）などの糖タンパク質又はＣＡ－１９－９などのグリカン自体である。ただし、タンパク質及びそのタンパク質上のグリカンの同一性が推定されるグライコプロテオミクス（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）には固有の難しさがあるため、ほとんどの糖タンパク質バイオマーカーアッセイは、ＣＥＡの場合のようにタンパク質自体のみ、又はＣＡ－１９－９の場合は、グリカン自体のみを対象とする。最近の研究では、特定のタンパク質上の特定のグリカンが癌のバイオマーカーとして機能する場合があり、多くの場合、タンパク質単独よりも優れたマーカーであることが示されている。しかしながら、このグリカン情報を取得することは煩雑かつ困難である。
【０００４】
現在、グリカンは、個々のタンパク質、又は血清や尿などの大きなタンパク質プールで検査されるが、グリカン情報は取得されても、タンパク質情報は失われる。したがって、妥協点は、グリカン結合部位を使用して１つずつ分析されたいくつかのタンパク質についてグリカン情報を取得できること、又はタンパク質群若しくはグリカン群（共にではなく）についてデータを取得できることである。この問題に対処する試みである１つのアプローチは、抗体レクチンアレイの使用である。この場合、特定のタンパク質に対する抗体がスライドガラス上にスポットされ(spotted)、捕捉された糖タンパク質上のグリカンが糖結合タンパク質（レクチン）で調べられる。このデータは特定の構造モチーフのエビデンスを提供するが、タンパク質におけるグリカンの多様性に対する真の洞察を提供するものでも、真の構造情報を提供するものでもない。
【０００５】
複合溶液中の特定の糖タンパク質の構造グリカン情報を提供する方法の必要性が依然として存在する。本発明はこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの試料のグリカン分析ための方法であって、複数の抗体がスポットされた表面を有する基板を提供する工程、
ブロッキング溶液中で前記基板をインキュベートする工程、
少なくとも１つの試料で前記基板をインキュベートする工程、
前記基板に酵素放出溶液を噴霧する工程、及び
質量分析によって前記基板をスキャンして、グリカンの存在を検出及び識別する工程、を含む、前記方法を提供する。
【０００７】
一実施形態では、前記少なくとも１つの試料が、少なくとも１つのタンパク質溶液を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの試料が、少なくとも１つの細胞集団を含む。一実施形態では、前記少なくとも１つの細胞集団が、前記基板に酵素放出溶液を噴霧する工程の前に、固定及びリンス剤（ａｆｉｘｉｎｇａｎｄｒｉｎｓｉｎｇａｇｅｎｔ）中でインキュベートされる。一実施形態では、前記固定及びリンス剤が、ホルマリン、カルノア液（Ｃａｒｎｏｙ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）、パラホルムアルデヒド、エタノール系固定剤、及びポリエチレングリコール系固定剤からなる群から選択される。
【０００８】
一実施形態では、前記基板がガラス又はプラスチックの顕微鏡スライド又はマルチウェルプレートである。一実施形態では、前記ブロッキング溶液が血清である。一実施形態では、前記血清が、ＰＢＳ及び洗浄剤中の１％ＢＳＡである。一実施形態では、前記ブロッキング溶液が、３×ＰＢＳ浴及び１×水浴を含む洗浄工程で除去される。一実施形態では、前記少なくとも１つの試料が、湿度チャンバー内で室温で２時間インキュベートされる。一実施形態では、前記酵素放出溶液がＰＮＧａｓｅＦを含む。
【０００９】
一実施形態では、前記質量分析は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージングフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ）質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析、走査型マイクロプローブＭＡＬＤＩ（ＳＭＡＬＤＩ）質量分析、赤外線マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化（ＭＡＬＤ－ＥＳＩ）質量分析、表面支援レーザー脱離イオン化（ＳＡＬＤＩ）質量分析、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）質量分析、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、及びイージーアンビエントソニックスプレーイオン化（ＥＡＳＩ）質量分析からなる群から選択される。一実施形態では、前記スキャンする工程は、前記基板にＭＡＬＤＩマトリックス材料を噴霧する工程が先行する。一実施形態では、前記ＭＡＬＤＩマトリックス溶液が、２，５－ジヒドロキシ安息香酸、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸、１，５－ジアミノナフタレン、及び９－アミノアクリジンからなる群から選択される。
【００１０】
一実施形態では、前記複数の抗体が、Ａ１ＡＴ、フェチュイン－Ａ、ヘモペキシン、Ａｐｏ－Ｊ、ＬＭＷキニノーゲン、ＨＭＷキニノーゲン、ａｐｏ－Ｈ、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、フィブロネクチン、ラミニン、セルロプラスミン、フィブリン、アンギオテンシノーゲン、フィブリリン－１、ＴＩＭＰ１、トロンボスポンジン１、ガレクチン－３結合タンパク質、補体Ｃ１Ｒ、クラステリン、ガレクチン１、α－２－マクログロブリン、ビタミンＤ結合タンパク質、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、ＣＤ１０９、ＣＥＡ、カテプシン、ＡＦＰ、ＧＰ７３１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する。一実施形態では、前記抗体が肝細胞癌の存在を検出するのに有用である。
（【００１１】以降は省略されています）

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