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公開番号2024163219
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-21
出願番号2024151276,2023020564
出願日2024-09-03,2018-06-08
発明の名称N-置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法
出願人中外製薬株式会社
代理人個人,個人,個人
主分類C07K 1/06 20060101AFI20241114BHJP(有機化学)
要約【課題】本発明は、N-置換アミノ酸またはN-置換アミノ酸類縁体を含むペプチドを高純度かつ高効率にて製造する、新規な方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明に係るN-置換アミノ酸又はN-置換アミノ酸類縁体を含むペプチドの製造方法は、
Fmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体、またはFmoc保護ペプチドを準備する工程、
Fmoc保護アミノ酸等のFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護する工程、および
新たなFmoc保護アミノ酸等を添加して、アミド結合を形成する工程を含み、
ペプチドの製造が固相法によって行われる場合には、得られたペプチドを、TFAよりも弱酸となる条件下で固相から切り出すことを特徴とする。また、得られたペプチドの少なくとも1つの側鎖が、塩基性条件下では脱保護されずTFAよりも弱酸となる条件下で脱保護される保護基を有することを特徴とする。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
少なくとも１つのＮ－置換アミノ酸又はＮ－置換アミノ酸類縁体を含むペプチドの製造方法であって、
１）ペプチドを準備する工程であって、前記ペプチドを構成するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の少なくとも１つの側鎖が、塩基性条件下では脱保護されず、水中でのｐＫａの値が１～５である弱酸とイオン化能Ｙ
ＯＴｓ
値が正の値で水中でのｐＫａが５～１４である溶媒を含む、弱酸溶液を用いる条件下で脱保護される保護基を有する工程、
２）前記保護基を、前記弱酸溶液を用いる条件下で脱保護する工程を含む、製造方法。
続きを表示（約 2,900 文字）【請求項２】
工程１）で準備する前記ペプチドが、１つの反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基をＣ末端側に含み、かつもう１つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体をＮ末端側に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記１つの反応点と前記もう１つの反応点とを結合させ、前記ペプチドを環化させる工程をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記もう１つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体がＮ末端にあり、かつ前記結合がアミド結合である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記もう１つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体がＮ末端にあり、かつ前記結合が炭素－炭素結合である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
工程１）において、前記保護基は、ヒドロキシ基、フェノール基、イミダゾール基、およびカルボン酸基から選択される少なくとも1つの官能基を保護している、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
側鎖の保護基が、ｐＨ１からｐＨ７の範囲で脱保護される保護基であるか、又は１０％以下のＴＦＡにおいて脱保護される保護基である、請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
側鎖の保護基が以下のａ）～ｄ）から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の製造方法：
ａ）側鎖の保護基がＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｙｐ、及び、それらの誘導体の側鎖のヒドロキシル基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるＭＯＭ骨格基、Ｂｎ骨格、Ｄｐｍ骨格、Ｔｒｔ骨格、シリル骨格及びＢｏｃ骨格から選ばれるいずれかの保護基；
ｂ）側鎖の保護基がＴｙｒ及びその誘導体の側鎖のヒドロキシル基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるＭＯＭ骨格、Ｂｎ骨格、Ｄｐｍ骨格、Ｔｒｔ骨格、シリル骨格、Ｂｏｃ骨格及びｔＢｕ骨格から選ばれるいずれかの保護基；
ｃ）前記側鎖の保護基がＨｉｓ及びその誘導体の側鎖のイミダゾール環の保護基である場合、以下の一般式で表わされるＭＯＭ骨格、Ｂｎ骨格及びＴｒｔ骨格から選ばれるいずれかの保護基；
ｄ）前記側鎖の保護基がＡｓｐ、Ｇｌｕ、及び、それらの誘導体の側鎖のカルボン酸基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるＭＯＭ骨格、Ｂｎ骨格、Ｄｐｍ骨格、Ｔｒｔ骨格、ｔＢｕ骨格、フェニル－ＥＤＯＴｎ骨格及び保護をするカルボン酸基の炭素原子を３つのアルコキシ基が置換した骨格に変換したオルトエステル骨格から選ばれるいずれかの保護基；
＜ＭＯＭ骨格を有する保護基＞
TIFF
2024163219000116.tif
23
149
（式中、
Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＨであり、かつＸはメチル、ベンジル、４－メトキシベンジル、２，４－ジメトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、または２－トリメチルシリルエチルであるか、
Ｒ１はメチルであり、Ｒ２はＨであり、かつＸはエチルであるか、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、いずれもメチルであるか、または
Ｒ１とＸは、一緒になって－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－または－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－を形成し、かつＲ２はＨであり
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＸのいずれかがメチルまたはエチルである場合、これらの基はさらにアルキル、ベンジル、またはアリールで置換されていてもよい。）
＜Ｂｎ骨格を有する保護基＞
TIFF
2024163219000117.tif
55
149
（式中、
Ｒ１～Ｒ５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつＲ６およびＲ７はアルキルであるか、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、Ｒ３はメトキシであり、かつＲ６およびＲ７はＨであるか、
Ｒ１およびＲ３がメトキシであり、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつＲ６およびＲ７はＨであるか、または
Ｒ１、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつＲ２とＲ３は一緒になって－Ｏ－ＣＨ
２
－Ｏ－を形成する。）
＜Ｄｐｍ骨格を有する保護基＞
TIFF
2024163219000118.tif
90
149
（式中、
Ｒ１～Ｒ１０は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、または
Ｒ１～Ｒ４およびＲ７～Ｒ１０は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつＲ５およびＲ６は一緒になって－Ｏ－または－ＣＨ
２
－ＣＨ
２
－を形成する。）
＜Ｔｒｔ骨格を有する保護基＞
TIFF
2024163219000119.tif
103
149
（式中、
Ｒ１～Ｒ１５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４～Ｒ１５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつＲ３は、メチルまたはメトキシであるか、
Ｒ１はＣｌであり、かつＲ２～Ｒ１５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、または
Ｒ１～Ｒ４、およびＲ７～Ｒ１５は、それぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつＲ５とＲ６は一緒になって－Ｏ－を形成する。）
＜シリル骨格を有する保護基＞
TIFF
2024163219000120.tif
30
149
（式中、
Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立してアルキル、またはアリールである。）
＜Ｂｏｃ骨格を有する保護基＞
TIFF
2024163219000121.tif
54
149
【請求項９】
溶媒が、フルオロアルコールである、請求項１から８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
フルオロアルコールがＴＦＥ又はＨＦＩＰである、請求項１から９のいずれかに記載の製造方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成において、高純度かつ高い合成効率にて合成することが可能なペプチドの新規な合成方法に関する。
続きを表示（約 2,500 文字）【背景技術】
【０００２】
ペプチドは医薬品としてこれまでに４０種以上が上市されている価値の高い化学種である（非特許文献１）。中でも、環状ペプチドやＮ－メチル化（もしくはＮ－アルキル化）された非天然型ペプチドは、脂溶性の向上による膜透過性の向上や、加水分解酵素への耐性獲得による代謝安定性の向上が見込まれている（非特許文献２）。最近、細胞内へ移行させたり、経口剤としたりするための鍵となるドラッグライク（薬らしさ：好ましくは、膜透過性と代謝安定性の両立を示す。）な環状ペプチドについての考察が進行している（非特許文献３、４）。また、ドラッグライクな環状ペプチドに必要とされる条件を明らかにした特許文献が公開され（特許文献１）、創薬におけるその重要性とその認知度が高まってきている。
【０００３】
一方で、Ｎ－アルキルアミノ酸などに代表される非天然型アミノ酸を数多く含むペプチド合成法の開発の進捗は比較すると限定的である。多くが天然型ペプチドで確立された手法をそのまま非天然型ペプチドに適用している。
【０００４】
ペプチドの合成法として、Ｆｍｏｃ法とＢｏｃ法が広く知られており、これらの多くの知見は、天然型ペプチドの合成法の開発から得られた。Ｆｍｏｃ基は酸に対して安定であるため、Ｎ末端のアミノ基をＦｍｏｃ基で保護した場合、その脱保護反応はＤＢＵやピペリジンといった塩基によって行う。そのため、ペプチド側鎖官能基の保護基として、例えば酸にて脱保護可能なものを利用し、Ｎ末端のアミノ基の選択的な脱保護を行ってペプチド鎖の伸長を行う。良く利用される保護基として、Ｆｍｏｃ法ではアミノ酸側鎖の保護基にはｔ－ブチル（ｔＢｕ）基やトリチル（Ｔｒｔ）基など、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）程度の酸での脱保護が可能なものを採用でき、Ｂｏｃ法に比べて温和な条件にて、樹脂からのペプチドの切り出し工程や側鎖官能基の保護基の脱保護をおこなうことができる。
【０００５】
しかしながら、比較的温和な条件での樹脂からの切り出し工程や側鎖官能基の保護基の脱保護を行えるＦｍｏｃ法による固相合成法においても、ＴＦＡを用いた樹脂からの切り出し工程もしくは側鎖官能基に有する保護基の脱保護工程において、Ｎ－アルキル化されたペプチド合成には以下のような問題点があることが明らかになってきた。
【０００６】
通常、Ｆｍｏｃ法にてペプチド合成を行った場合、樹脂からの切り出し工程や側鎖官能基の保護基の脱保護は、ＴＦＡを用いることが一般的である。多くの場合、樹脂からの切り出し反応と側鎖官能基の脱保護反応を、９０％ＴＦＡ水溶液を用いて、同時に行う。しかしながら、Ｎ－メチル化されたペプチド、特にＮ－メチルアミノ酸が連続している配列の場合には、オキサゾロニウム経由での酸加水分解が進行し、ペプチド鎖が切断されてしまう副反応が知られている（非特許文献５、６）。また、セリンやスレオニンといったβ－ヒドロキシ基を有するアミノ酸が配列中に含まれているペプチドの場合には、ＴＦＡを用いたこれらの工程において、酸加水分解だけでなく、Ｎ→Ｏアシルシフト反応も副反応として進行し、デプシペプチド化してしまう可能性があることが知られている（非特許文献７、８）。
【０００７】
この酸を用いた切り出し工程および脱保護工程における加水分解の問題に対しては、低濃度のＴＦＡ溶液を用いて、反応時間を短く制御することで回避しようとする試みが行われている。例えばAlbericioらの報告によると、NMe-IB-01212と命名されたペプチドの固相合成の際、Ｎ－メチル化された環状ヘキサペプチドに含まれるアミノ基上のＢｏｃ基の脱保護をＴＦＡ－ＤＣＭ（１：１）の溶液で行った場合、Ｎ－Ｍｅ部位でのペプチドの分解が認められた。分解を避けるべく、より低濃度のＴＦＡを用いたり、反応時間を最小限にしたりすることで改善を試みているものの、充分な改善には至っていない（非特許文献９）。そもそも、これまでのペプチド合成に汎用される保護基では、低濃度のＴＦＡ溶液での脱保護工程では、樹脂からの切り出し反応は満足できる速度にて進行する一方、側鎖の脱保護反応が進行しないか、進行が極端に遅い場合がある。
【０００８】
また、高度にＮ－メチル化されたペプチドの加水分解と同じ反応機構で進行するＮ末端のＡｃ－ＭｅＰｈｅの切断を防ぐために、FangらはＴＦＡを用い、反応温度を４℃まで低下させてＡｒｇ側鎖の保護基であるＰｂｆ基の脱保護を行っている（非特許文献１０）。しかし温度を下げるこの方法においても、Ａｃ－ＭｅＰｈｅの切断を完全に防ぎきることは難しく、目的物が極大となる時間で反応を停止させるに留まっている。
【０００９】
さらに、脱保護時の問題点に加えて、伸長工程における低反応性の問題も知られている。新たに形成させるアミド結合のＮ末端がＮ－メチルアミノ酸である場合、その２級アミンの嵩高さによって、続くアミノ酸とのアミド形成反応（伸長反応）が十分に進行しない場合がある（非特許文献２、５）。
【００１０】
この伸長工程での問題点に対しては、全く同じ反応条件を２度かそれ以上繰り返すことによって、未反応点を減らすという工夫がなされてきた（２度繰り返す方法はダブルカップリングと呼ばれている）。また、縮合するアミノ酸の活性化について、例えばより高活性な酸ハライドに替えることによって、縮合効率を改善しようと取り組まれてきた（非特許文献１１）。しかしながら、ダブルカップリングのように同じ反応条件を繰り返し行う場合には、時間と試薬コストが２倍かそれ以上かかってしまうし、酸ハライドでの縮合を行う場合には、要事調製が必要であり、なおかつ生成した酸ハライドがペプチド合成の工程の間に安定に存在し得るかの点にも懸念が残る。また、反応によってＨＣｌやＨＦが発生してしまうため、脱保護反応が進行してしまう懸念があるという点も問題となりうる。
（【００１１】以降は省略されています）

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