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公開番号2024161555
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-19
出願番号2024139422,2021545269
出願日2024-08-21,2019-10-14
発明の名称複製欠損型ウイルスベクター及びウイルスの感染性を測定するための方法
出願人リジェネクスバイオインコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12Q 1/70 20060101AFI20241112BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】複製欠損型ウイルス及びウイルスベクターの感染性を測定するための改善された方法を提供する。
【解決手段】ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、a.標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物を別々に接種する工程と、b.前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、c.前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、d.前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー(VGC):標的細胞ゲノムコピー(TCGC)の比を決定する工程とを含む、前記方法である。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
a.標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物を別々に接種する工程と、
b.前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
c.前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
d.前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と
を含む、前記方法。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
a.前記試験組成物及び参照組成物の系列希釈物を調製する工程と、
b.標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物の前記系列希釈物を別々に接種する工程と、
c.前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
d.前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
e.前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記系列希釈物が、１０倍未満の希釈物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記系列希釈物が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記系列希釈物が、２倍の希釈物である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記系列希釈物が、少なくとも２種類の希釈物、少なくとも３種類の希釈物、少なくとも５種類の希釈物、または少なくとも１０種類の希釈物を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記系列希釈物が、２～２０種類の希釈物を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
平行線モデルを用いて、前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する工程をさらに含む、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する前記工程が、
a.試験組成物及び参照組成物の各希釈度についてのＶＧＣ：ＴＣＧＣ比を計算することと、
b.前記試験組成物及び参照組成物についての対数希釈度に対し対数ＶＧＣ：ＴＣＧＣ比をプロットすることと、
c.共通の傾きを用いて、前記試験組成物及び参照組成物のデータポイントを試験組成物及び参照組成物の線にフィットさせることと、
d.前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を
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128
として計算することと
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
変動係数（ｃｖ）が、約１００％未満、約５０％未満、または約２５％未満である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１５日出願の米国特許仮出願第６２／７４５，８５９号の優先権を主張し、当該出願の全体が本明細書に援用される。
続きを表示（約 6,300 文字）【背景技術】
【０００２】
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。
【０００３】
複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。限界希釈エンドポイント解析による感染力価の絶対的定量化（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイとしても知られる）は、ｉｎｖｉｔｒｏでの組換えウイルス（例えば、ＡＡＶ）調製物の感染性を測定するための標準的な方法となっている。ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイは、ＡＡＶベクター調製物の感染性を確認するのに有用ではあるが、アッセイ変動性が大きい（幾何変動係数が最大２００％）ため、製品適合性、比較性、及び安定性の支持に対する適用性が制限される。したがって、複製欠損型ウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を含む組成物の感染性を測定するためのより正確な方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示は、ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、標的細胞へのウイルス粒子の接種を可能にする条件下で、当該標的細胞を当該試験組成物及び当該参照組成物に接触させる工程と、細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該試験組成物及び参照組成物を接種された当該標的細胞からそれぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、当該試験核酸試料及び当該参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、標的細胞は、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物と接触される。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１０倍未満の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験組成物及び参照組成物の系列希釈物は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、試験試料及び参照試料の系列希釈物は、２倍の希釈物である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、平行線モデルを用いて参照試料に対する試験試料の感染性を計算する工程を含む。いくつかの実施形態において、核酸試料中のＶＧＣ及びＴＣＧＣはポリメラーゼ連鎖反応によって決定される。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応は定量的ポリメラーゼ連鎖反応である。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応はデジタルポリメラーゼ連鎖反応である。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は複製欠損型ウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子は、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はレトロウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、複製欠損型ウイルス粒子はＡＡＶ粒子、例えば組換えＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞はＨｕｈ－７細胞である。
【０００５】
本開示は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１～６のうちの１つのヌクレオチド配列を含む約１５～約４０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは検出可能に標識され、このとき検出可能な標識はポリヌクレオチドに共有結合している。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は蛍光標識である。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、及びＲＯＸのうちの１つ以上を含む。
【０００６】
本開示は、目的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、本明細書で説明される１つ以上のポリヌクレオチドを用いて、生物学的試料からのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応に供する工程を含む、方法を提供する。
【０００７】
本開示は、本明細書で説明される１つ以上のポリヌクレオチドを含む試料中のｒＡＡＶを検出するためのキットを提供する。
【０００８】
本開示は、ウイルス粒子を含む参照試料の感染性に対するウイルス粒子を含む試験試料の感染性を決定するためのキットであって、（ａ）ウイルス配列を増幅可能であり、任意選択でプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマー、（ｂ）標的細胞ゲノム配列を増幅可能であり、任意選択でプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマー、ならびに（ｃ）ウイルス参照試料のうちの１つ以上を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、ウイルス配列を増幅可能であり、任意選択でプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマーは、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞のゲノム配列を増幅可能であり、任意選択的にプローブを伴う、順方向及び逆方向プライマーは、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含む。
【０００９】
本開示はさらに、異なる条件下でのウイルス粒子の組成物の相対的感染性を決定するための方法であって、第１及び第２の条件セットの下で、標的細胞にウイルス粒子を含む当該組成物を接種する工程と、当該接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、当該第１及び第２の条件セットの下で接種された標的細胞から、それぞれ第１及び第２の核酸試料を単離する工程と、当該第１及び第２の核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程とを含む、方法を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する。
［１］ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
［ａ］標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物を別々に接種する工程と、
［ｂ］前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
［ｃ］前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
［ｄ］前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、前記方法。
［２］ウイルス粒子を含む参照組成物の感染性に対するウイルス粒子を含む試験組成物の感染性を決定するための方法であって、
［ａ］前記試験組成物及び参照組成物の系列希釈物を調製する工程と、
［ｂ］標的細胞に前記試験組成物及び参照組成物の前記系列希釈物を別々に接種する工程と、
［ｃ］前記接種された細胞を洗浄して細胞外のウイルス粒子を除去する工程と、
［ｄ］前記試験組成物及び参照組成物を接種された前記標的細胞から、それぞれ試験核酸試料及び参照核酸試料を単離する工程と、
［ｅ］前記試験核酸試料及び前記参照核酸試料におけるウイルスゲノムコピー（ＶＧＣ）：標的細胞ゲノムコピー（ＴＣＧＣ）の比を決定する工程と、を含む、前記方法。
［３］前記系列希釈物が、１０倍未満の希釈物である、［２］に記載の方法。
［４］前記系列希釈物が、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または８倍の希釈物である、［２］に記載の方法。
［５］前記系列希釈物が、２倍の希釈物である、［２］に記載の方法。
［６］前記系列希釈物が、少なくとも２種類の希釈物、少なくとも３種類の希釈物、少なくとも５種類の希釈物、または少なくとも１０種類の希釈物を含む、［２］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］前記系列希釈物が、２～２０種類の希釈物を含む、［２］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［８］平行線モデルを用いて、前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する工程をさらに含む、［２］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を計算する前記工程が、
［ａ］試験組成物及び参照組成物の各希釈度についてのＶＧＣ：ＴＣＧＣ比を計算することと、
［ｂ］前記試験組成物及び参照組成物についての対数希釈度に対し対数ＶＧＣ：ＴＣＧＣ比をプロットすることと、
［ｃ］共通の傾きを用いて、前記試験組成物及び参照組成物のデータポイントを試験組成物及び参照組成物の線にフィットさせることと、
［ｄ］前記参照組成物に対する前記試験組成物の感染性を
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として計算することと
を含む、［８］に記載の方法。
［１０］変動係数（ｃｖ）が、約１００％未満、約５０％未満、または約２５％未満である、［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］標的細胞に接種する前記工程が、ウイルス粒子の存在下で前記標的細胞を
［ａ］約５分から約３日の間、
［ｂ］約１２時間から約３６時間の間、
［ｃ］約１８時間から約３０時間の間、
［ｄ］約１時間、約２時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、もしくは約３６時間、
「ｅ」約１日、もしくは約１．５日、もしくは約２日、または
［ｆ］約２４時間
にわたってインキュベートすることを含む、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］核酸組成物中の前記ＶＧＣ及びＴＣＧＣがポリメラーゼ連鎖反応によって決定される、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］前記ポリメラーゼ連鎖反応が定量的ポリメラーゼ連鎖反応である、［１２］に記載の方法。
［１４］前記ポリメラーゼ連鎖反応がデジタルポリメラーゼ連鎖反応である、［１２］に記載の方法。
［１５］前記ウイルス粒子が複製欠損型ウイルスである、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］前記複製欠損型ウイルスが、ＡＡＶ、アデノウイルス、ワクシニア、またはレンチウイルスである、［１５］に記載の方法。
［１７］前記複製欠損型ウイルスがレトロウイルスである、［１５］に記載の方法。
［１８］前記複製欠損型ウイルスがＡＡＶである、［１５］に記載の方法。
［１９］前記ＡＡＶが組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である、［１８］に記載の方法。
［２０］前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、［１９］に記載の方法。
［２１］前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、［２０］に記載の方法。
［２２］前記標的細胞が、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、ＢＥＡＳ－２ＢＳ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐａ１－６、またはＡ５４９細胞である、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３］前記標的細胞がＨｕｈ－７細胞である、［２２］に記載の方法。
［２４］前記試験組成物及び前記参照組成物が同じ力価を有し、前記力価がミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される、［１］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２５］前記試験組成物及び前記参照組成物が異なる力価を有し、前記力価がミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される、［１］～［２３］のいずれか１つに記載の方法。
［２６］前記試験組成物の前記力価が、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子である、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］前記参照組成物の前記力価が、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌ～約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子である、［２４］～［２６］のいずれか１つに記載の方法。
（【００１１】以降は省略されています）

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