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公開番号2024161055
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-15
出願番号2024141090,2022544779
出願日2024-08-22,2021-01-22
発明の名称安定化されたNAを有する組換えインフルエンザウイルス
出願人ウィスコンシンアルムニリサーチファンデイション,国立大学法人東京大学
代理人個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12N 7/01 20060101AFI20241108BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本明細書には、ワクチンの生成効率を向上させ、それによってワクチンウイルスの収量を向上できる、安定化されたNA四量体を有する修飾されたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼが述べられている。
【解決手段】本発明は安定化されたノイラミニダーゼ(NA)四量体を有するウイルス粒子を形成するNA単量体をコードするNAウイルス断片を含む、単離された組換えインフルエンザウイルスを提供する。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
安定化されたノイラミニダーゼ（ＮＡ）四量体を有するウイルス粒子を形成するＮＡ単量体をコードするＮＡウイルス断片を含む、単離された組換えインフルエンザウイルス。
続きを表示（約 730 文字）【請求項２】
修飾されていないＮＡストークを含むＮＡを有するインフルエンザウイルスに対比して、安定化された四量体を生成する修飾されたＮＡストークを有する、請求項１に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項３】
前記修飾されたＮＡストークが欠失を有する、請求項２に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項４】
前記修飾されたＮＡストークが挿入を有する、請求項２または３に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項５】
前記修飾されたＮＡストークが、前記修飾されていないストークに対比して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項２、３、または４に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項６】
前記修飾されたＮＡストークでの少なくとも１つの置換が、システイン置換である、請求項５に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項７】
前記修飾されたＮＡストークが、少なくとも２つの置換を有する、請求項５に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項８】
前記ＮＡが、Ｎ１の付番に対して４８位にシステインを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項９】
前記ＮＡが、Ｎ１の付番に対して５０位にシステインを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
前記ＮＡが、Ｎ１の付番に対して４８位および５０位にシステインを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えインフルエンザウイルス。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２４日付け出願の米国出願第６２／９６５，２２５号の出願日の利益を主張し、その開示は２０～３０件の参照によって本明細書内に組み込まれる。
続きを表示（約 4,300 文字）【０００２】
連邦政府からの資金援助の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所から授与されたＨＨＳＮ２７２２０１４００００８Ｃの下での政府の支援を受けて実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザは、ウマなどの一部の哺乳類での主な呼吸器疾患であり、毎年、相当数の罹患および経済損失が発生している。また一部の鳥類では、インフルエンザウイルスに感染すると、重篤な全身疾患を引き起こし、死に至る可能性もある。インフルエンザウイルスゲノムが分割されるという性質により、２種以上のインフルエンザウイルスに感染した細胞では、ウイルスが複製される際に分割断片は再結合する。この断片の再結合は、遺伝子の変異や浮動との組合せによって、経時的に無数の分岐したインフルエンザウイルス株を生み出す可能性がある。これらの新たな株は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質の抗原変異を示し、特にＨＡタンパク質をコードする遺伝子は高い変異率を有する。現状のインフルエンザ予防の実務は、ワクチン接種が主流である。最も一般的には、不活化ウイルスワクチンが使用される。インフルエンザＨＡタンパク質は、ウイルスに対する宿主の防御免疫応答の主要な標的抗原でありかつ変異率が高いので、最新の流行に関連するインフルエンザウイルスの単離およびＨＡ抗原の同定かつ特性解析は、ワクチン製造には重要なものとなる。流行の状況および予測に基づいて、ワクチンは、主流になると予測されるインフルエンザウイルス株に対して防御免疫応答を刺激するように設計される。
【０００４】
インフルエンザウイルスには、一般的にＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型の４種類があり、これらのウイルスは、それらの内部のタンパク質間に血清学的な交差反応性が存在しないことで定義されている。Ａ型インフルエンザウイルスは、その糖タンパク質であるＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の抗原性の差異かつ遺伝的な差異に基づいて、さらに亜型に分類される。既知のＨＡ亜型およびＮＡ亜型（Ｈ１～Ｈ１８およびＮ１～Ｎ１１）は全て水鳥から単離されていて、これら水鳥はインフルエンザの天然の保菌宿主として作用すると考えられている。
【０００５】
ＮＡに対する抗体は、インフルエンザウイルス感染症の予防に重要な役割を果たすことが示唆されている。しかし、卵中で増殖させたインフルエンザウイルスの不活化およびウイルス抗原の精製により生成された現状のインフルエンザワクチンでは、抗ＮＡ抗体を効率的に誘発することは不可能である。
【発明の概要】
【０００６】
抗ＮＡ抗体の産生量が少なくなる原因の一つは、ホモ四量体として働くＮＡタンパク質の構造的な不安定性に起因している。ＮＡの四量体は、抗原精製過程中に破壊される可能性がある。従って現状のワクチンが含むＮＡの量は、抗ＮＡ抗体の産生を誘発するのに不十分である。
【０００７】
本開示は、その天然のホモ四量体構造を安定化させる、ＮＡタンパク質中に特定の残基または修飾を持つインフルエンザウイルスに関し、かつそのウイルスを生成し、例えばワクチンにそのウイルスを用いる方法に関する。一実施態様では、安定化されたＮＡ四量体を有するウイルス粒子を形成するＮＡ単量体をコードするノイラミニダーゼ（ＮＡ）ウイルス断片を含む単離された組換えインフルエンザウイルスが提供される。一実施態様では、組換えインフルエンザウイルスは、安定化四量体をもたらす、親ＮＡに対して修飾されたＮＡストークを持つ。一実施態様では、修飾ＮＡストークは欠失を持つ。一実施態様では、修飾ＮＡストークは、親ＮＡに対して挿入を持つ。一実施態様では、修飾ＮＡストークは、親ＮＡに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を持つ。一実施態様では、修飾ＮＡストークの少なくとも１つの置換は、システイン置換である。一実施態様では、修飾ＮＡストークは、親ＮＡに対して少なくとも２つの置換を持つ。一実施態様では、ＮＡは、Ｎ１の付番に対して４８位にシステインを持つ。一実施態様では、ＮＡは、Ｎ１の付番に対して５０位にシステインを持つ。一実施態様では、ＮＡは、Ｎ１の付番に対して４８位と５０位の位置にシステインを持つ。一実施態様では、ＮＡストークは、親ＮＡに対して膜貫通ドメインのＣ末端から１～１０残基内で修飾される。一実施態様では、ＮＡストークは、膜貫通ドメインのＣ末端から１０～２０残基内で修飾される。一実施態様では、ＮＡストークは、膜貫通ドメインのＣ末端から２０～３０残基内で修飾される。一実施態様では、ＮＡストークは、膜貫通ドメインのＣ末端から３０～５０残基内で修飾される。一実施態様では、ストークドメインは、ジスルフィド結合を形成するＮＡのヘッド領域内で、保存されたシステインに至るＮＡの膜貫通ドメイン内の最終残基の後の最初の残基で始まり、あるいは保存されたシステインの前の１～２残基で始まる（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８７：１０５３９（２０１３）を参照）。一実施態様では、ＮＡストークでの挿入は、１、２、３、４、または５、あるいは５～１０、あるいは１０～２０、あるいはそれ以上の残基での挿入である。一実施態様では、ＮＡストークでの欠失は、１、２、３、４、または５、あるいは５～１０、あるいは１０～２０、あるいはそれ以上の残基での欠失である。一実施態様では、ストーク領域にシステインを持つＮＡは、例えば、別のシステインの１～１０残基または１～５残基内で修飾された第２または第３のシステインを含む。一実施態様では、ＮＡは、互いに１～２、２～３、３～４または５までの各残基内にある少なくとも２つのシステインをストーク領域内に持つ。一実施態様では、ＮＡは、ストーク領域内に少なくとも２つのシステインを有し、そのうちの一方は、ＮＡ内の４８残基のＮ末端またはＣ末端のいずれかの５残基内にあり、そのうちの他方は、ＮＡ内の５０残基のＮ末端またはＣ末端のいずれかの５残基内にある。一実施態様では、システインは互いに隣接し、例えば、４６および４７残基、４６、４７、および４８残基、４７および４８残基、４７、４８、および４９残基、４８および４９残基、４８、４９、および５０残基、４９および５０残基、または４９、５０、および５１残基にあり、一実施態様では両方はストーク領域内に存在する。一実施態様では、システインは２つ離れた残基にあり、一実施態様では両方はストーク領域内に存在し、例えばシステインは、４６および４８、４７および４９、４８および５０、４９および５１、５０および５２、５１および５３などの各残基にある。一実施態様では、システインは３つ離れた残基にあり、例えばシステインは、４５および４８、４６および４９、４７および５０、４８および５１、４９および５２、５０および５３、５１および５４などの各残基にあり、一実施態様では、両方はストーク領域内に存在する。一実施態様では、システインは４つ離れた残基にあり、例えばシステインは、４４および４８、４５および４９、４６および５０、４７および５１、４８および５２、４９および５３、５０および５４、５１および５５などの各残基にあり、一実施態様では、両方はストーク領域内に存在する。一実施態様では、ストーク領域は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下のシステイン残基を持つ。一実施態様では、ストーク領域内のシステインは、ストーク領域のＮ末端の３０残基内に存在する。一実施態様では、ストーク領域内のシステインは、ストーク領域のＮ末端の２０残基内に存在する。
【０００８】
本明細書での記載のように、構造的に安定化されたノイラミニダーゼ四量体を発現する高増殖性の組換えインフルエンザウイルスを調製した。一実施態様では、ＮＡ－４８ＣもしくはＮＡ－５０Ｃのいずれか、または両方を含む組換えインフルエンザウイルスは、安定化ＮＡ四量体を発現しかつ効率的に複製する。従って、構造的に安定化されたＮＡ四量体を発現する高増殖性の組換えインフルエンザウイルスの生成を可能にするインフルエンザＮＡでのアミノ酸変異を用いて、より多量のＮＡ抗原を含むインフルエンザワクチン、すなわち抗ＮＡ抗体を効率的に誘発できるより多量のＮＡ抗原を含むインフルエンザワクチン株を生成できる。
【０００９】
一実施態様では、有効量の組換えインフルエンザウイルスまたはその一部分を含むワクチンが提供される。一実施態様では、ワクチンは、全ウイルスワクチンである。一実施態様では、ワクチンは、スプリットウイルスワクチンである。一実施態様では、ワクチンは、サブユニットワクチンである。一実施態様では、ワクチンはさらにアジュバントを含む。一実施態様では、ワクチンはさらに薬学的に許容可能な担体を含む。一実施態様では、担体は鼻腔内投与または筋肉内投与に適している。一実施態様では、ワクチンはさらに、少なくとも１種のその他のインフルエンザウイルス単離株を含む。
【００１０】
一実施態様では、安定化ＮＡ四量体を持つインフルエンザウイルスを調製する方法が提供される。この方法は、安定化ＮＡ四量体を持つインフルエンザウイルスを生成するのに有効な量で、１つ以上のベクターを細胞に接触させる工程を含み、この１つ以上のベクターは、例えばストーク領域内に少なくとも１つのシステインをコードするインフルエンザウイルスＮＡ断片用の核酸、インフルエンザウイルスＰＡ断片用の核酸、インフルエンザウイルスＰＢ１断片用の核酸、インフルエンザウイルスＰＢ２断片用の核酸、インフルエンザウイルスＮＰ断片の用の核酸、インフルエンザウイルスＮＳ断片用の核酸、インフルエンザウイルスＭ断片用の核酸、およびインフルエンザウイルスＨＡ断片用の核酸を含む。一実施態様では、ＮＡは、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、またはＮ５である。一実施態様では、ＮＡは、Ｎ４、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、またはＮ９である。一実施態様では、細胞は哺乳類細胞である。一実施態様では、細胞は、Ｖｅｒｏ細胞、２９３Ｔ細胞、またはＭＤＣＫ細胞である。
（【００１１】以降は省略されています）

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