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公開番号2024156907
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2024129867,2021502052
出願日2024-08-06,2020-02-18
発明の名称相補部分を含む修飾オリゴヌクレオチドの製造方法
出願人味の素株式会社
代理人弁理士法人酒井国際特許事務所
主分類C12N 15/10 20060101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】本発明は、siRNAやヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド等の相補部分を含むオリゴヌクレオチドの効率的な製造方法を提供する。
【解決手段】より具体的には、11~27塩基長の相補部分を含む修飾オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
該方法は、合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片をオリゴヌクレオチドリガーゼの存在下で処理して該修飾オリゴヌクレオチドを生成することを含み、
該合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片は、該修飾オリゴヌクレオチドを、下記条件(i)~(v)を満たす断片連結部で分けた場合に得られるオリゴヌクレオチド原料断片に相当する、方法:
(i)断片連結部は、相補部分の各鎖側中のそれぞれに1以上存在し、かつ断片連結部は、該修飾オリゴヌクレオチド中に合計2つ以上存在し;
(ii)該修飾オリゴヌクレオチドを断片連結部で分けた場合に、突出末端が相補部分中に形成され、かつ該突出末端が1~10塩基長であり;
(iii)少なくとも1本のオリゴヌクレオチド原料断片が、修飾ヌクレオチドを含み、
(iv)該合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片のうち4本のオリゴヌクレオチド原料断片が、5~25塩基長の相補部分を含み、かつ
(v)オリゴヌクレオチド原料断片の相補部分の各鎖側に相当する塩基長の合計が、いずれも11~27塩基長である、方法を提供する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項1】
11~27塩基長の相補部分を含む修飾オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
該方法は、合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片をオリゴヌクレオチドリガーゼの存在下で処理して該修飾オリゴヌクレオチドを生成することを含み、
合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片は、該修飾オリゴヌクレオチドを、下記条件(i)~(v)を満たす断片連結部で分けた場合に得られるオリゴヌクレオチド原料断片に相当する、方法:
(i)断片連結部は、相補部分の各鎖側中のそれぞれに1以上存在し、かつ断片連結部は、該修飾オリゴヌクレオチド中に合計2つ以上存在し;
(ii)該修飾オリゴヌクレオチドを断片連結部で分けた場合に、突出末端が相補部分中に形成され、かつ該突出末端が1~10塩基長であり;
(iii)少なくとも1本のオリゴヌクレオチド原料断片が、修飾ヌクレオチドを含み、
(iv)該合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片のうち4本のオリゴヌクレオチド原料断片が、5~25塩基長の相補部分を含み、かつ
(v)オリゴヌクレオチド原料断片の相補部分の各鎖側に相当する塩基長の合計が、いずれも11~27塩基長である。
続きを表示(約 1,500 文字)【請求項2】
(ii)における突出末端が、2~6塩基長である、請求項1記載の方法。
【請求項3】
(iv)で規定される4本のオリゴヌクレオチド原料断片の相補部分における突出末端以外の部分が、4~16塩基長である、請求項1または2記載の方法。
【請求項4】
オリゴヌクレオチドリガーゼが、RNAリガーゼである、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
オリゴヌクレオチドリガーゼが、二本鎖RNAリガーゼである、請求項4記載の方法。
【請求項6】
二本鎖RNAリガーゼが、Rnl2ファミリーまたはRnl5ファミリーのRNAリガーゼである、請求項5記載の方法。
【請求項7】
修飾オリゴヌクレオチドが、修飾型ヌクレオチド残基を含む、請求項1~6のいずれか一項記載の方法。
【請求項8】
修飾型ヌクレオチド残基が、1’、2’、3’、もしくは4’化学修飾型ヌクレオチド残基、5’-または3’-リン酸基修飾型ヌクレオチド残基、架橋型修飾型ヌクレオチド残基、キャリア付加修飾型ヌクレオチド残基、または糖骨格置換型ヌクレオチド残基である、請求項7記載の方法。
【請求項9】
修飾型ヌクレオチド残基が、
i)1’、2’、3’、もしくは4’部位が、C
1~6
アルキルオキシC
1~6
アルキレン、-O-C
1~6
アルキル、-O-C
6~14
アリール、-C-アリール、ハロゲン原子、-O-C
1~6
アルキルN-アミドC
1~6
アルキレン、-O-C
1~6
アルキル-(C
1~6
アルキル-)アミノ-C
1~6
アルキレン、または-O-アミノC
1~6
アルキル(例、-O-アミノプロピル、-O-AP)で置換された、1’、2’、3’、もしくは4’化学修飾型ヌクレオチド残基;
ii)水酸基が、保護基で置換されていてもよい、-O-Ρ(S)(OH)

、-NH-Ρ(O)(OH)

、もしくは-NH-Ρ(S)(OH)

で置換された、5’-もしくは3’-リン酸基修飾型ヌクレオチド残基;
iii)2’部位と4’部位が、2’-O-C
1~6
アルキレン-4’、2’-O-エチレン-4’、2’-O-メチル置換メチレン-4’、2’-O-C
1~6
アルキレン-O-C
1~6
アルキレン-4’、2’-O-N(R)-C
1~6
アルキレン-4’(ここで、Rはメチル、水素原子またはベンジルを示す)、2’-N(R)-C(O)-4’、2’-NH-C
1~6
アルキレン-4’、もしくは、2’-C
1~6
アルキレン-4’に置換された、または、3’部位と5’部位が、3’-C
1~6
アルキレン-5’に置換された、架橋型修飾型ヌクレオチド残基;または
iv)ヘキシトール核酸(HNA)残基、シクロヘキセニル核酸(CeNA)残基、もしくはモルフォリノ核酸(PMO)残基
である、請求項8記載の方法。
【請求項10】
オリゴヌクレオチド原料断片より選ばれる任意の2本のオリゴヌクレオチド原料断片の全モル比が、0.5~2である、請求項1~9のいずれか一項記載の方法。
(【請求項11】以降は省略されています)

発明の詳細な説明【技術分野】
【0001】
本発明は、相補部分を含む修飾オリゴヌクレオチドの製造方法に関する。
続きを表示(約 5,600 文字)【背景技術】
【0002】
siRNA、アンチセンス等のオリゴヌクレオチドは、核酸医薬としての有用性が示され、近年、開発が活発化している。オリゴヌクレオチドは、主に合成法にて製造されており、例えば、ホスホロアミダイト法など固相合成にてヌクレオチド残基を1塩基ずつ順次直列的に伸長合成することにより製造することができる。しかしながら、この手法は、オリゴヌクレオチドの鎖長が長くなるにつれて産物の純度および収量が低下したり、製造効率が低いなどの課題を有している。そこで、オリゴヌクレオチドを各短鎖断片として合成し、それらを縮合して目的のオリゴヌクレオチドを得る並列的合成手法が求められている。
【0003】
特許文献1には、目的のオリゴヌクレオチドを分割した断片に相当する複数のオリゴヌクレオチド原料断片を、目的のオリゴヌクレオチドに相補的な鋳型オリゴヌクレオチドとアニールさせ、アニールしたオリゴヌクレオチド原料断片同士を酵素的に縮合させ、得られた目的のオリゴヌクレオチド鎖を鋳型オリゴヌクレオチドから分離することにより、一本鎖オリゴヌクレオチドを製造することが記載されている。
非特許文献1には、オリゴDNA断片とPEG化オリゴDNA断片を、付着性末端においてDNAリガーゼで連結させることによる、オリゴDNAのPEG化が記載されている。しかし、非特許文献1では天然型オリゴDNA断片でしか実施していないため、アニーリング能の低下が示唆される短鎖かつ修飾型塩基を含むオリゴヌクレオチドを原料として用いた、相補部分を含むオリゴヌクレオチドの酵素的縮合が可能であるかどうかは不明である。
非特許文献2および3には、1本のオリゴヌクレオチド鎖とこれに相補的な2本のオリゴヌクレオチド原料断片をアニールさせることにより形成されるニックを、リガーゼで連結させることが記載されている。
非特許文献4には、付着性末端を有する24mer二本鎖オリゴRNAをRNAリガーゼで連結させて、48mer以上の大きさを有する二本鎖RNAを形成させることが記載されている。しかしながら、非特許文献4では、基質は24塩基長、生成物も48塩基長といずれも長いことから、基質のアニーリング能が高い条件でしか実施していないため、アニーリング能が著しく低下することが示唆される短鎖かつ修飾型塩基の導入による酵素の連結活性の低下が予想されるオリゴヌクレオチド基質を用いた場合に2箇所以上の縮合点を有する酵素反応が進行するかは知られていなかった。
非特許文献5には、siRNAを合成的に作成したことが記載されている。
非特許文献6には、RNAリガーゼDraRnlがRnl5ファミリーに含まれることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
米国特許出願公開第2018/0023122号明細書
【非特許文献】
【0005】
Sosic A, Pasqualin M, Pasut G, Gatto B. 2014. Enzymatic formation of PEGylated oligonucleotides. Bioconjug Chem 25:433-441.
Bullard, D. R., & Bowater, R. P. (2006). Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J, 398, 135-144.
Nandakumar, J., & Shuman, S. (2004). How an RNA Ligase Discriminates RNA versus DNA Damage. Molecular Cell, 16(2), 211-221.
Nandakumar J, Ho CK, Lima CD, Shuman S. 2004. RNA substrate specificity and structure-guided mutational analysis of bacteriophage T4 RNA ligase 2. J Biol Chem 279:31337-31347.
Jayaprakash K. Nair, et al. (2014), Multivalent N-Acetylgalactosamine-Conjugated siRNA Localizes in Hepatocytes and Elicits Robust RNAi-Mediated Gene Silencing. J. Am. Chem. Soc., 136, 16958-16961.
MIHAELA-CARMEN UNCIULEAC and STEWART SHUMAN (2019),RNA 21:824-832
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、siRNAやヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド等の相補部分を含むオリゴヌクレオチドの効率的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意検討した結果、目的の相補部分を含むオリゴヌクレオチドの両相補部分を分割した断片に相当する4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片をオリゴヌクレオチドリガーゼで処理することにより、二本鎖などの相補部分を含むオリゴヌクレオチドを直接構築することを見出し、固相合成などの直列合成法に比し高い製造効率、高い純度で製造できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
従来、siRNAなど、比較的短い二本鎖オリゴヌクレオチドは、化学合成が容易かつ簡便であったことから、化学合成により製造されていた。具体的には、構成する2本のオリゴヌクレオチド鎖をそれぞれ化学合成(例、固相合成)し、それらを精製後、両鎖をアニーリングさせることによって製造されていた。そのため、酵素的縮合を用いる方法はさほど報告されておらず、その中でも、4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片から酵素的合成する方法は、28塩基長以上の比較的長鎖の二本鎖オリゴヌクレオチドを製造する方法しか報告されていなかった。短いオリゴヌクレオチドは、その製造に用いられるオリゴヌクレオチド原料断片の塩基長も自ずと短くなるが、短い塩基長のオリゴヌクレオチド原料断片は、アニーリング能も低下すると考えられる。構成するヌクレオチドが修飾されているとさらにアニーリング能が低下してしまうことも考えられた。したがって、リガーゼを用いる酵素的なオリゴヌクレオチド合成手法では、オリゴヌクレオチド原料断片のアニーリング能が重要と考えられていたことから、リガーゼを用いて4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片とした28塩基長未満などのより短鎖のオリゴヌクレオチドを製造する方法は試みられていなかった。
しかし、本発明者らは、鋭意検討した結果、予想に反して、リガーゼおよび4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片を用いた場合、アニーリング能に影響されることなく、28塩基長未満の二本鎖オリゴヌクレオチドを首尾よく製造できることを見出した。また、短鎖のオリゴヌクレオチドの場合、製造されるオリゴヌクレオチドの純度も向上することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕11~27塩基長の相補部分を含む修飾オリゴヌクレオチドの製造方法であって、
該方法は、合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片をオリゴヌクレオチドリガーゼの存在下で処理することを含み、
該合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片は、該修飾オリゴヌクレオチドを、下記条件(i)~(v)を満たす断片連結部で分けた場合に得られるオリゴヌクレオチド原料断片に相当する、方法:
(i)断片連結部は、相補部分の各鎖側中のそれぞれに1以上存在し、かつ断片連結部は、該修飾オリゴヌクレオチド中に合計2つ以上存在し;
(ii)該修飾オリゴヌクレオチドを断片連結部で分けた場合に、突出末端が相補部分中に形成され、かつ該突出末端が1~10塩基長であり;
(iii)少なくとも1本のオリゴヌクレオチド原料断片が、修飾ヌクレオチドを含み、
(iv)該合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片のうち4本のオリゴヌクレオチド原料断片が、5~25塩基長の相補部分を含み、かつ
(v)オリゴヌクレオチド原料断片の相補部分の各鎖側に相当する塩基長の合計が、いずれも11~27塩基長である。
〔2〕(ii)における突出末端が、2~6塩基長である、〔1〕の方法。
〔3〕(iv)で規定される4本のオリゴヌクレオチド原料断片の相補部分における突出末端以外の部分が、4~16塩基長である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕オリゴヌクレオチドリガーゼが、RNAリガーゼである、〔1〕~〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕オリゴヌクレオチドリガーゼが、二本鎖RNAリガーゼである、〔4〕の方法。
〔6〕二本鎖RNAリガーゼが、Rnl2ファミリーまたはRnl5ファミリーのRNAリガーゼである、〔5〕の方法。
〔7〕修飾オリゴヌクレオチドが、修飾型ヌクレオチド残基を含む、〔1〕~〔6〕のいずれかの方法。
〔8〕修飾型ヌクレオチド残基が、1’、2’、3’、もしくは4’化学修飾型ヌクレオチド残基、5’-または3’-リン酸基修飾型ヌクレオチド残基、架橋型修飾型ヌクレオチド残基、キャリア付加修飾型ヌクレオチド残基、または糖骨格置換型ヌクレオチド残基である、〔7〕の方法。
〔9〕修飾型ヌクレオチド残基が、
i)1’、2’、3’、もしくは4’部位が、C
1~6
アルキルオキシC
1~6
アルキレン、-O-C
1~6
アルキル、-O-C
6~14
アリール、-C-アリール、ハロゲン原子、-O-C
1~6
アルキルN-アミドC
1~6
アルキレン、-O-C
1~6
アルキル-(C
1~6
アルキル-)アミノ-C
1~6
アルキレン、または-O-アミノC
1~6
アルキル(例、-O-アミノプロピル、-O-AP)で置換された、1’、2’、3’、もしくは4’化学修飾型ヌクレオチド残基;
ii)水酸基が、保護基で置換されていてもよい、-O-Ρ(S)(OH)

、-NH-Ρ(O)(OH)

、もしくは-NH-Ρ(S)(OH)

で置換された、5’-もしくは3’-リン酸基修飾型ヌクレオチド残基;
iii)2’部位と4’部位が、2’-O-C
1~6
アルキレン-4’、2’-O-エチレン-4’、2’-O-メチル置換メチレン-4’、2’-O-C
1~6
アルキレン-O-C
1~6
アルキレン-4’、2’-O-N(R)-C
1~6
アルキレン-4’(ここで、Rはメチル、水素原子またはベンジルを示す)、2’-N(R)-C(O)-4’、2’-NH-C
1~6
アルキレン-4’、もしくは、2’-C
1~6
アルキレン-4’に置換された、または、3’部位と5’部位が、3’-C
1~6
アルキレン-5’に置換された、架橋型修飾型ヌクレオチド残基;または
iv)ヘキシトール核酸(HNA)残基、シクロヘキセニル核酸(CeNA)残基、もしくはモルフォリノ核酸(PMO)残基
である、〔8〕の方法。
〔10〕合計4本以上のオリゴヌクレオチド原料断片より選ばれる任意の2本のオリゴヌクレオチド原料断片の全モル比が、0.5~2である、〔1〕~〔9〕のいずれかの方法。
〔11〕オリゴヌクレオチド原料断片が、10mM以下の一価カチオン塩濃度下で処理される、〔1〕~〔10〕のいずれかの方法。
〔12〕前記処理することの前に、オリゴヌクレオチド原料断片混合溶液を高温に置きその後クールダウンすることが行われない、〔1〕~〔11〕のいずれかの方法。
〔13〕前記修飾オリゴヌクレオチドの不純物の生成が抑制される、〔1〕~〔12〕のいずれかの方法。
〔14〕前記修飾オリゴヌクレオチドを精製することをさらに含む、〔1〕~〔13〕のいずれかの方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明の方法によれば、siRNAやヘテロ二本鎖オリゴヌクレオチド等の修飾オリゴヌクレオチドを効率的に高純度で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
(【0011】以降は省略されています)

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