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公開番号2024151882
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-25
出願番号2023065657
出願日2023-04-13
発明の名称デジタルPCR法にて細菌数を正確に測定する方法
出願人国立大学法人富山大学
代理人個人,個人
主分類C12N 15/54 20060101AFI20241018BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】デジタルPCR法によって、正確な菌数を測定する。
【解決手段】ターゲット遺伝子をrpoB遺伝子とし、rpoBフォーワードプライマーあるいはrpoBフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と、rpoBリバースプライマーあるいはrpoBリバースプライマーを含むプライマー混合物とを含む、プライマーペア、およびrpoBプローブ混合物を用いることによって、デジタルPCR法で正確な菌数を測定する。
【選択図】図2
特許請求の範囲【請求項１】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１種のｒｐｏＢフォーワードプライマーと；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１種のｒｐｏＢリバースプライマーと；
を含む、プライマーペア。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
【請求項３】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
【請求項４】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
【請求項５】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１５種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１２種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
【請求項６】
（ａ）配列番号１～１９からなるｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなるｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
【請求項７】
（１）請求項１～６のいずれか1項に記載のプライマーペアと；
（２）配列番号３４～４３からなるｒｐｏＢＴａｑＭａｎプローブを含むプローブ混合物と；
を含む、ＰＣＲ用試薬。
【請求項８】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
【請求項９】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルＰＣＲ法の細菌定量検査方法に関する。
続きを表示（約 4,200 文字）【背景技術】
【０００２】
現在、感染症の重症度を反映するバイオマーカーとして、プロカルシトニン、プレセプシン、体温、白血球数、CRPなどがある。これらのバイオマーカーは感染症の重症度とある程度は相関するが、必ずしもその時点での重症度を正確に反映している訳ではない。
【０００３】
そこで、「患者検体中の起炎菌数（菌数/mL）」を正確に測定することが出来れば、菌数を感染症の重症度を正確に判断するための新規バイオマーカーとして使用できるようになる。本発明者は、特定のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法を用いて、菌の定量を行う方法や（特許文献１）、特定のＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ法を用いて、正確・高感度に菌の定量を行う方法（特許文献２）を提唱してきた。
【０００４】
また、局方に記載された従来の微生物試験法では「無菌」の判定までに１週間以上（７～１４日）を要する。例えば、図１に示す通り、従来法（最もスタンダードな方法）では液体培地に試料を混入後、培地の混濁の有無を目視で確認することになるが、培地の混濁には多量の菌数が必要となるため、無菌の確認には１４日間の培養時間を要する。局方に記載された迅速無菌検査法であるバクテアラート法は、細菌の排出するCO
2
の有無を検出するが、CO
2
の検出にはそれなりの菌数が必要となるため、無菌の確認には７日間の培養時間を要する。つまり、従来法もバクテアラート法も検出感度が低いため、無菌を判定するために多くの培養時間が必要になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
ＷＯ２０１９／１２３６９２
ＷＯ２０１０／０８２６４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
デジタルＰＣＲ法（digital PCR）は核酸を定量する目的で開発された方法である。この方法を用いて特に患者検体中の菌数を正確に測定することが出来れば、感染症における臨床検査の新規技術として非常に有用となる。しかし、デジタルＰＣＲ法で正確な菌数を定量しようとする場合、１６ＳリボソームＲＮＡ（ribosomal RNA）遺伝子をターゲットとすると、１つの菌に複数の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子が含まれる（operon copy numberとして菌種毎に含まれる遺伝子数は異なる）ため、ＤＮＡが断片化した際に、真の菌数より多く算出され、正確な菌数を測定するのが困難である。特に、臨床検体中の菌数を測定する場合、正確な菌数の測定が必須となり、デジタルＰＣＲ法を使用することが困難となる。また、多くの種類の菌に関して、迅速に検体中の菌の有無を判定する方法が求められている。従って、ＤＮＡが断片化しても、デジタルＰＣＲ法で正確に菌数の測定が行える技術的工夫が強く求められている。
【０００７】
ところで、無菌検査法に関して、日本薬局方に記載された従来の微生物試験法では「無菌」の判定までに１週間以上（７～１４日）を要するので、その間、無菌性製品（医薬品等）の出荷前の物流コストがかかる。また、万が一、その無菌性製品に微生物感染が判明すれば、その間に製造した無菌性製品は全て破棄しなければならなくなる。さらに、再生医療等製品は作成後直ぐに使用しなければならず、現行の無菌検査では間に合わない。つまり、社会的にも医療的にも迅速な無菌検査の実現が求められている。そして無菌検査もまたデジタルPCR法で実施出来れば非常に有用となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、菌種毎に1個の細菌が保持する遺伝子数（operon copy number）が異なり、複数個を保持するため（例えばE.coliは1個の細菌中に７つの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を保持する）、ＤＮＡが断片化するとデジタルＰＣＲでの菌数測定は、実際より増えることになる。
【０００９】
この問題を解決するため、以下のプライマー、プローブセットを設計、作成した。
・ターゲット遺伝子は、全ての細菌種において、「１個の細菌中に１つの遺伝子しか存在しない」ｒｐｏＢ遺伝子とした。
・ｒｐｏＢ遺伝子には「全ての細菌種に完全に保存された塩基配列領域」である保存配列（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎ）は存在しない。従って、全ての細菌種をほぼ同等に検出するために、ｍｉｘｅｄｐｒｉｍｅｒ、ｍｉｘｅｄｐｒｏｂｅのセットを設計、作成した。特に臨床検査で用いる場合、ヒト由来ＤＮＡが含まれ、インターカレーターではバックグラウンドが高くなり使用出来ないため、ｐｒｏｂｅで検出することが必須である。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１種のｒｐｏＢフォーワードプライマーと；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１種のｒｐｏＢリバースプライマーと；
を含む、プライマーペア。
（２）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（３）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（４）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（５）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１５種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１２種のｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（６）（ａ）配列番号１～１９からなるｒｐｏＢフォーワードプライマーを含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなるｒｐｏＢリバースプライマーを含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（７）（１）請求項１～６のいずれか1項に記載のプライマーペアと；
（２）配列番号３４～４３からなるｒｐｏＢＴａｑＭａｎプローブを含むプローブ混合物と；
を含む、ＰＣＲ用試薬。
（８）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも２種のｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（９）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも５種のｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（１０）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１０種のｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（１１）（ａ）配列番号１～１９からなる群から選択される少なくとも１５種のｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなる群から選択される少なくとも１２種のｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（１２）（ａ）配列番号１～１９からなるｒｐｏＢフォーワードプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
（ｂ）配列番号２０～３３からなるｒｐｏＢリバースプライマーを等量ずつ含むプライマー混合物と；
を含む、プライマーペア。
（１３）（ｉ）上記（１）～（６）のいずれか1つに記載のプライマーペアと；
（ｉｉ）配列番号３４～４３からなるｒｐｏＢＴａｑＭａｎプローブを等量ずつ含むプローブ混合物と；
を含む、ＰＣＲ用試薬。
（１４）上記（１）から（１３）のいずれか1つに記載のプライマーペアを用いてデジタルＰＣＲを行う、検体中の菌の定量方法。
（１５）上記（７）または（１３）に記載のＰＣＲ試薬を用いる、上記（８）または（１４）に記載の定量方法。
（１６）上記（１５）を迅速無菌検査に用いる場合、検体中の菌の増殖の有無を判定する方法であって、
（ｉ）培養前の検体中の菌の核酸を抽出する工程、
（ｉｉ）検体を培養する工程、
（ｉｉｉ）培養後の検体中の菌の核酸を抽出する工程、
（ｉｖ）培養前後の核酸について、上記（７）または（１３）に記載のＰＣＲ試薬を用いてデジタルＰＣＲを行う工程、
（ｖ）培養前後で核酸が増加した場合に、検体中の生菌が増殖したと判定する工程、
を有する方法。
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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