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公開番号2024143318
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-11
出願番号2023055931
出願日2023-03-30
発明の名称メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子多型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ
出願人東洋紡株式会社
代理人
主分類C12Q 1/6876 20180101AFI20241003BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子多型を検出することができるオリゴヌクレオチドプローブを提供すること。
【解決手段】MTHFRの677位における遺伝子多型を検出するために用いられる、以下の特徴(A)及び(B)を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
(A)特定の6種類の配列のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも15塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において一又は数個の塩基の相違を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、MTHFRの677位に相当する位置の塩基が末端塩基から4塩基以上離れた位置に存在するオリゴヌクレオチドを含む。
(B)少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ＭＴＨＦＲの６７７位における遺伝子多型を検出するために用いられる、以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有するオリゴヌクレオチドプローブ。
（Ａ）配列番号１～６のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列、或いはそれらの塩基配列において一又は数個の塩基の相違を有する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、ＭＴＨＦＲの６７７位に相当する位置の塩基が末端塩基から４塩基以上離れた位置に存在するオリゴヌクレオチドを含む。
（Ｂ）少なくとも一方の末端塩基がグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識されている。
続きを表示（約 1,100 文字）【請求項２】
前記（Ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号１～６のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列からなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
ＭＴＨＦＲの６７７位における遺伝子多型がＣＣ型、ＴＴ型又はＣＴ型のいずれであるかを検出するために用いられる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
前記（Ｂ）において、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンである請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
前記（Ｂ）の蛍光消光色素が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
請求項１～６のいずれかに記載のプローブを用いることを特徴とする、ＭＴＨＦＲの６７７位における遺伝子多型を検出する方法。
【請求項８】
ＭＴＨＦＲの６７７位における遺伝子多型がＣＣ型、ＴＴ型又はＣＴ型のいずれであるかを判別する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１～６のいずれかに記載のプローブを含む、ＭＴＨＦＲの６７７位における遺伝子多型を検出するためのキット。
【請求項１０】
配列番号７～１０のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列、或いはそれらの塩基配列において一又は数個の塩基の相違を有する塩基配列を含むプライマーと、
配列番号１１～１４のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列、或いはそれらの塩基配列において一又は数個の塩基の相違を有する塩基配列を含むプライマーとを含むプライマーセットであって、
一方のプライマーが他方のプライマーの核酸伸長生成物に相補的であるプライマーセットを更に含む、請求項９に記載のキット。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＭＴＨＦＲとも称する）の遺伝子多型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。更に、本発明は、該オリゴヌクレオチドプローブを用いて、試料中に含まれるＭＴＨＦＲの遺伝子多型を検出する方法及びその方法に用いるための試薬・キット等に関する。
続きを表示（約 1,900 文字）【背景技術】
【０００２】
ヒトは様々な遺伝子多型を持っており、それにより個体差が生じる。遺伝子多型とは一般的に人の個体間に１％以上の頻度で見いだされる遺伝子間の相違のことであり、そのうちの９０％が遺伝子の１個の塩基が変異した１塩基多型（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰｓ）である。
【０００３】
判明しているＳＮＰだけでも１００万種類以上あるとされており、ＳＮＰの中には、高血圧、心臓疾患、がんなどの疾患の発症と関係するものや薬剤代謝と関係するもの、ヒトの体質に関係するものなどが存在し、ヒトＳＮＰ診断の重要性は年々高まっている。
【０００４】
これまでに妊娠中のリスクに関係するＳＮＰも報告されている。妊娠中のリスク要因としては、母子の栄養不良状態、飲酒、喫煙またはホルモン剤の使用等が挙げられるが、とりわけ、葉酸代謝に関する遺伝子のＳＮＰは母子の栄養不良状態の１つである血中高ホモシステインを引き起こす。これにより、二分脊椎を代表とする胎児の神経管閉鎖障害のリスクが高まることが報告されている。また、血中高ホモシステインは心血管疾患や脳卒中、認知症のリスクを高めることも明らかにされており、血中ホモシステイン代謝にかかわる葉酸代謝関連遺伝子のＳＮＰ型判定は非常に重要である。
【０００５】
葉酸代謝過程において、ホモシステインは必須アミノ酸であるメチオニンが代謝されて生成されるアミノ酸であり、再メチル化経路とイオウ転移経路により代謝される。前者では、ビタミン１２（Ｂ１２）を補酵素とするメチオニン合成酵素（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ：ＭＳ）によりホモシステインがメチオニンに転換される。
【０００６】
ホモシステインをメチオニンに代謝するために、摂取葉酸由来の５－メチルテトラヒドロ葉酸がメチル基供与体として必要である。本経路において、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸を５－メチルテトラヒドロ葉酸へ代謝する為に必須である酵素が葉酸代謝関連遺伝子の１つであるメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＭＴＨＦＲ）であり、この経路の律速である。
【０００７】
葉酸代謝関連遺伝子の多型はいくつか存在するが、その中でも、ＭＴＨＦＲの６７７番目のシトシンがチミンに置換されたＭＴＨＦＲＣ６７７Ｔは心血管疾患や神経管閉鎖障害等の重篤疾患に関係することが明らかにされている（非特許文献１）。
【０００８】
そこで、高感度な核酸増幅法を用いることで、ＭＴＨＦＲの遺伝子多型を検出する方法が開発されてきた（非特許文献２）。例えば、ＤｉｒｅｃｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法やＲＦＬＰ法があげられる。前記ＤｉｒｅｃｔＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法は、例えば、試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析する方法である。前記ＲＦＬＰ法は、例えば、まず、試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域をＰＣＲにより増幅させる。そして、前記検出対象配列における目的の変異の有無により切断作用が異なる制限酵素によって、その増幅物を切断し、電気泳動することでタイピングを行う方法である。
【０００９】
しかしながら、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコスト、時間がかかる。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要がある。このため、前記増幅物が次の反応系に混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析できないという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
平岡ら、葉酸代謝関連遺伝子に基づくテーラーメイド栄養学―さかど葉酸プロジェクト―、ＴｈｅｖｉｔａｍｉｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＪａｐａｎ、２００９、８３、ｐ．２６４－２７５
三ツ口ら、メチレンテトラヒドロ還元酵素遺伝子多型Ｃ６７７Ｔと葉酸摂取量、血清葉酸値および血漿ホモシステイン値との関連 ―葉酸添加発酵乳を用いたシングルアーム介入試験―、名古屋栄養科学雑誌、２０１７、３、ｐ．２５－３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
（【００１１】以降は省略されています）

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