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公開番号2024156361
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-11-06
出願番号2023070761
出願日2023-04-24
発明の名称マイコプラズマ・ジェニタリウム検出用プローブ及びその用途
出願人東洋紡株式会社,国立大学法人筑波大学
代理人弁理士法人三枝国際特許事務所
主分類C12N 15/09 20060101AFI20241029BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】マイコプラズマ・ジェニタリウム検出用プローブを提供すること。
【解決手段】以下の特徴(A)及び(B)を有する、マイコプラズマ・ジェニタリウム(Mycoplasma genitalium)検出用プローブ:
(A)以下の(A-1)又は(A-2)の塩基配列を含む;
(A-1)配列番号1で示される塩基配列の72～100番目の領域の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列において連続する少なくとも15塩基の塩基配列であって、マイコプラズマ・ジェニタリウムのParC遺伝子配列の247位、248位、及び249位に相当する位置の3つの塩基の領域を少なくとも含む塩基配列、又は
(A-2)(A-1)の塩基配列において1～3個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列;及び
(B)5’末端又は3’末端のいずれか一方のみが標識されている。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasma genitalium）検出用プローブ：
（Ａ）以下の（Ａ－１）又は（Ａ－２）の塩基配列を含む；
（Ａ－１）配列番号１で示される塩基配列の７２～１００番目の領域の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列であって、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位に相当する位置の３つの塩基の領域を少なくとも含む塩基配列、又は
（Ａ－２）（Ａ－１）の塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列；及び
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
続きを表示（約 1,000 文字）【請求項２】
前記（Ａ）において、配列番号１で示される塩基配列におけるＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位に相当する位置の３つの塩基が、それぞれ独立して、アデニン塩基、グアニン塩基、及びチミン塩基から選択される、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記（Ａ）において、配列番号１で示される塩基配列におけるＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位に相当する位置の３つの塩基からなる配列がＡＧＴ又はＡＴＴである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号７～１７のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記（Ａ）の塩基配列の長さが１５～３０塩基である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項９】
前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１に記載のプローブ。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウム検出用プローブ、該プローブを用いてマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法及び当該方法に用いるための試薬・キット等に関する。
続きを表示（約 6,000 文字）【背景技術】
【０００２】
性感染症は性的接触によって感染する病気であり、無症状や自覚しない軽症の場合も多く、感染がいつの間にか広がってしまうという問題がある。性感染症を引き起こす原因細菌としては、Chlamydia trachomatis、Neisseria gonorrhoeaeが代表例として挙げられる。更に、その他の原因細菌として、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Ureaplasma parvum、Ureaplasma urealyticum、Trichomonas vaginalis、Treponema pallidum等も知られている。
【０００３】
これらの性感染症を引き起こす原因細菌のうち、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasma genitalium）は、膿性や漿液性の尿道分泌物を伴う尿道炎を引き起こすことが報告されており、これを簡便、迅速、高感度に検出することは臨床診断上重要である。マイコプラズマ・ジェニタリウム感染症に対しては、マクロライド系抗菌薬が最もよく治療に用いられている。しかしながら、マクロライド系抗菌薬に対して耐性を持つ株が報告されており、マクロライド系抗菌薬による治療が難しいケースも確認されている。さらに、マイコプラズマ・ジェニタリウム感染症の治療にキノロン系抗菌薬も用いられるが、キノロン系抗菌薬に対しても耐性を持つ株が報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
Anna Vesty et al., Mycoplasma genitalium Antimicrobial Resistance in Community and Sexual Health Clinic Patients, Auckland, New Zealand., Journal of Emerging Infectious Diseases,February 2022 Volume 26 Number 2
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型又は変異型を問わず可能な限り網羅的に検出できる方法の開発が求められている。また、野生型及び変異型の両方を検出できるだけでなく、マイコプラズマ・ジェニタリウムの抗生物質（キノロン系抗菌薬等）に対する耐性の有無についても簡便、迅速、且つ高感度に検出する方法の開発が望まれている。
本発明の主な目的は、マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出に有用なプローブ及びそれを用いたマイコプラズマ・ジェニタリウムの検出方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究した結果、特定の塩基配列を有する標識プローブを用いることで、マイコプラズマ・ジェニタリウムを簡便、迅速、且つ高感度に検出できることを見出した。本発明者らは、当該知見を基に更に鋭意研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasma genitalium）検出用プローブ：
（Ａ）以下の（Ａ－１）又は（Ａ－２）の塩基配列を含む；
（Ａ－１）配列番号１で示される塩基配列の７２～１００番目の領域の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列において連続する少なくとも１５塩基の塩基配列であって、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位に相当する位置の３つの塩基の領域を少なくとも含む塩基配列、又は
（Ａ－２）（Ａ－１）の塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列；及び
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項２］前記（Ａ）において、配列番号１で示される塩基配列におけるＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位に相当する位置の３つの塩基が、それぞれ独立して、アデニン塩基、グアニン塩基、及びチミン塩基から選択される、項１に記載のプローブ。
［項３］前記（Ａ）において、配列番号１で示される塩基配列におけるＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位に相当する位置の３つの塩基からなる配列がＡＧＴ又はＡＴＴである、項１又は２に記載のプローブ。
［項４］前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号７～１７のいずれかで示される塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列を含む、項１～３のいずれかに記載のプローブ。
［項５］前記（Ａ）の塩基配列の長さが１５～３０塩基である、項１～４のいずれかに記載のプローブ。
［項６］前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、項１～５のいずれかに記載のプローブ。
［項７］前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、項１～６のいずれかに記載のプローブ。
［項８］前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１～７のいずれかに記載のプローブ。
［項９］前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～８のいずれかに記載のプローブ。
［項１０］前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ローダミン６Ｇ、テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～９のいずれかに記載のプローブ。
［項１１］前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、項１～１０のいずれかに記載のプローブ。
［項１２］項１～１１のいずれかに記載のプローブを用いて、検体試料中に含まれ得るマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出する方法。
［項１３］以下の工程（１）、（２）、及び（３）：
（１）マイコプラズマ・ジェニタリウムを含み得る検体試料を提供する工程、
（２）工程（１）の検体試料を、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列の一部又は全部を鋳型とする核酸増幅反応に供する工程、及び
（３）工程（２）の核酸増幅反応で生成し得る１又は複数の核酸増幅産物を、１又は複数の前記プローブを用いて検出する工程、
を含む、項１２に記載の方法。
［項１４］工程（２）がＰＣＲ反応により実施され、前記ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである項１３に記載の方法。
［項１５］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項１４に記載の方法。
［項１６］工程（２）の核酸増幅反応で使用するプライマーセットが、配列番号１の１～７１番目の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列において連続する１９～３２塩基の塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号１の９９～１４２番目の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列において連続する１９～３２塩基の塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセットであって、第二のプライマーが第一のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットである、項１３～１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］前記第一のプライマーが、配列番号１８及び１９のいずれかで示される塩基配列若しくはそれらに相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、かつ、前記第二のプライマーが、配列番号２０～２２のいずれかで示される塩基配列若しくはそれらに相補的な塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列からなる、項１６に記載の方法。
［項１８］マイコプラズマ・ジェニタリウムの野生型及びキノロン系抗生物質に対する耐性変異型の両方を検出する、項１２～１７のいずれかに記載の方法。
［項１９］マイコプラズマ・ジェニタリウムを野生型及びキノロン系抗生物質に対する耐性変異型のいずれであるかを判別して検出する、項１２～１８のいずれかに記載の方法。
［項２０］マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位における少なくとも１つの変異の有無を判別して検出する、項１２～１９のいずれかに記載の方法。
［項２１］マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列の２４８位における変異の有無を判別して検出する、項１２～２０のいずれかに記載の方法。
［項２２］工程（３）の検出する工程が、融解曲線分析により実施される、項１３～２１のいずれかに記載の方法。
［項２３］前記融解曲線分析において、キノロン系抗生物質に対する耐性変異型の検出温度が、野生型の検出温度より低い又は高い温度で検出される、項２２に記載の方法。
［項２４］前記融解曲線分析において、キノロン系抗生物質に対する耐性変異型の検出温度と、野生型の検出温度との間の差が４℃以上である、項２２又は２３に記載の方法。
［項２５］前記融解曲線分析において、キノロン系抗生物質に対する耐性変異型の検出温度と、野生型の検出温度との間の差が８℃以上である、項２２～２４のいずれかに記載の方法。
［項２６］項１～１１のいずれかに記載のプローブを含む、マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出するための試薬キット。
［項２７］配列番号１で示される塩基配列の１～７１番目の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列において連続する１９～３２塩基の塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列からなる第一のプライマーと、配列番号１で示される塩基配列の９９～１４２番目の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列において連続する１９～３２塩基の塩基配列、又はそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列からなる第二のプライマーとの組合せからなるプライマーセットであって、第二のプライマーが第一のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットを更に含む、項２６に記載の試薬キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、マイコプラズマ・ジェニタリウムを簡便、迅速、且つ高感度に検出することができる。また、本発明では、１種類のプローブを用いることにより、野生型及びキノロン系抗生物質に対して耐性を示す変異型の両方のマイコプラズマ・ジェニタリウムを検出することも可能である。さらに、本発明では、マイコプラズマ・ジェニタリウムを、野生型及びキノロン系抗生物質に対して耐性を示す変異型のいずれであるかを判別して検出することも可能となり、更に特定の実施態様では、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位の少なくとも１つの位置における変異の有無を判別して検出することも可能である。本発明のプローブ、それを用いた検出方法、試薬、又はキット等を使用することで、マイコプラズマ・ジェニタリウムの簡便、迅速、且つ高感度な検出が可能になり、臨床診断の分野に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は実施例１の結果の代表例（配列番号８で示されるプローブを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果）を示す。
図２は実施例２の結果の代表例（配列番号１９と配列番号２２で示されるプライマーの組合せで融解曲線解析を行った場合の検出結果）を示す。
図３は実施例３の結果の代表例（配列番号８で示されるプローブを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果）を示す。
図４は実施例４の結果の代表例（配列番号１３で示されるプローブを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果）を示す。
図５はマイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列（配列番号１）の一部と、試験例で用いた各プローブ及びプライマーの塩基配列との対応関係を示す図である。四角で囲んだ部分が、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＰａｒＣ遺伝子配列の２４７位、２４８位、及び２４９位に相当する位置の３つの塩基の領域（図５の例では、ＡＧＴ又はＡＴＴ）である。黒丸は蛍光消光色素の結合位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方又は両方を意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。
（【００１１】以降は省略されています）

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