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公開番号2024133943
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-10-03
出願番号2023043974
出願日2023-03-20
発明の名称グルクロン酸転移酵素
出願人公立大学法人富山県立大学,第一三共株式会社
代理人弁理士法人特許事務所サイクス
主分類C12N 15/54 20060101AFI20240926BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】放線菌のUGT酵素を同定し、放線菌のUGT酵素の異種発現によるグルクロン酸抱合体の製造方法を提供すること。
【解決手段】下記の(a)から(c)のいずれかのアミノ酸配列を有するUDP-グルクロン酸転移酵素が提供される。(a)特定のアミノ酸配列、(b)特定のアミノ酸配列と少なくとも80%配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を有するタンパク質がUDP-グルクロン酸転移活性を有する、アミノ酸配列、または(c)特定のアミノ酸配列において、1から複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および/または付加されたアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を有するタンパク質がUDP-グルクロン酸転移活性を有する、アミノ酸配列。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を有するＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素。
（ａ）配列番号２２、７３、７５および７６のいずれか一に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２２、７３、７５および７６のいずれか一に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を有するタンパク質がＵＤＰ－グルクロン酸転移活性を有する、アミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２２、７３、７５および７６のいずれか一に記載のアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列を有するタンパク質がＵＤＰ－グルクロン酸転移活性を有する、アミノ酸配列。
続きを表示（約 570 文字）【請求項２】
被抱合化合物のグルクロン酸抱合体を製造するために用いられる、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
Ｎ－グルクロン酸抱合体、Ｏ－アシルグルクロン酸抱合体、およびＯ－エーテルグルクロン酸抱合体から選択される１種または複数種を生産する、請求項１に記載の酵素。
【請求項４】
カルボキシ基、水酸基、および脂肪族または芳香族の窒素原子から選択される１種または複数種を抱合化する、請求項１に記載の酵素。
【請求項５】
請求項１に記載の酵素のアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主。
【請求項８】
さらに異種ＵＤＰ－グルコース脱水素酵素遺伝子および／またはＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジリル転移酵素遺伝子が導入された、請求項７に記載の宿主。
【請求項９】
請求項７または８に記載の宿主を用いるグルクロン酸転移酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の宿主を被抱合化合物とともに培養して、被抱合化合物のグルクロン酸抱合体を生成させることを含むグルクロン酸抱合体の製造方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、放線菌由来ＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素およびそれをコードする核酸に関する。さらに、本発明は、前記酵素を用いたグルクロン酸抱合体の製造方法に関する。
続きを表示（約 1,800 文字）【背景技術】
【０００２】
医薬品開発における代謝物評価については、２００８年に米国ＦＤＡより代謝物の毒性評価に関するガイダンスが発出され、近年、ヒト代謝物評価が重要視されている。グルクロン酸抱合体については、アシルグルクロナイドなど、グルクロン酸抱合体の一部は反応性代謝物になって毒性を示すことが問題視されており、安全性評価のためにはこれらの代謝物標準品が必要となる。
【０００３】
安全性評価には、動物実験が可能な程度の一定量の代謝物が必要となるが、化学合成では取得するのが困難な場合がある。例えば、グルクロン酸抱合体の場合、保護・脱保護工程が必要な化学合成では、一般的に安定的にグルクロン酸抱合体を得ることが困難であり、量的確保が課題となる。
【０００４】
グルクロン酸抱合体はＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）の働きにより産生される。ＵＧＴは、主に肝臓小胞体に局在する膜酵素であり、生体内外の異物（薬物や環境汚染物質、食品添加物など）である脂溶性化合物にグルクロン酸を転移するグルクロン酸抱合反応を触媒する。
【０００５】
微生物による異種タンパク質発現系を用いたグルクロン酸抱合体の製造方法が報告されている。特許文献１は、ヒトグルクロン酸転移酵素遺伝子を導入した酵母形質転換体を用いるグルクロン酸転移酵素の製造方法を報告する。さらに近年確立された方法ではＵＧＴの他にＵＤＰ－グルクロン酸をつくるためのＵＤＰ－グルコース－６－デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＵＧＤＨ）を酵母内で発現させることにより、酵母菌体を破砕することなく酵母菌体液に医薬品を混合して一日インキュベートするだけでグルクロン酸抱合体を製造することができ、大幅な生産性の向上およびコスト低減が可能になった（非特許文献１、特許文献２）。しかしながら、ヒト由来ＵＧＴのみを酵素源とした場合、基質特異性や産生能に限界があることから、他の生物種におけるグルクロン酸抱合能を有するＵＧＴ分子種の探索が必要であった。
【０００６】
上記のほか、微生物変換によるグルクロン酸抱合体の製造方法が報告されている。特許文献３は、放線菌菌体を用いたアシルグルクロン酸抱合体の製造方法を開示する。しかし、特許文献３においては、グルクロン酸転移反応を行う、放線菌のＵＧＴ遺伝子は同定されていなかった。ＵＧＴ酵素はＵＧＴモチーフ配列をもつが、これらを指標とした探索では糖代謝、糖鎖合成に関与する酵素群が優勢となる傾向があり、低分子化合物に対するＵＧＴ酵素を同定することは困難であった。さらに、アミノ酸配列情報のみからＵＧＴ酵素とそのほかの糖転移酵素を区別することも困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
特許第４９１８５８２号
特許第５０５１４８５号
ＷＯ２０１７／０７８１３７
【非特許文献】
【０００８】
Ikushiroetal.,Mol.Pharmaceutics13,2274,2016.
生城真一、衣斐義一、井柳堯:UDP－グルクロン酸転移酵素：薬物代謝における最近の進歩,肝臓,42,pp.297－301（2001）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、放線菌のＵＧＴ酵素を同定し、放線菌のＵＧＴ酵素の異種発現によるグルクロン酸抱合体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、グルクロン酸抱合活性を持つ菌株から以下の5段階の選抜を行うことで、放線菌のＵＧＴ酵素を複数同定し、これらの酵素により多様な化合物がＯ－、Ｎ－またはアシルグルクロン酸抱合体へ変換されることを確認し、さらに研究を進めることで本発明を完成するに至った。本発明はこの知見に基づくものである。
第一選抜：ＵＧＴｍｏｔｉｆを有するＵＤＰ－糖転移遺伝子をすべて選択（文献番号３）、
第二選抜：糖鎖合成に関与すると思われる分子種を排除、
第三選抜：糖代謝に関与すると思われる分子種を排除、
第四選抜：分子量が３０,０００以下、１００,０００以上の分子種を排除、
第五選抜：重複している分子種を排除
（【００１１】以降は省略されています）

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