発明の詳細な説明【技術分野】 【０００１】 本発明は、遊離脂肪酸生産藻類を用いた遊離脂肪酸の製造方法に関する。 続きを表示（約 4,600 文字）【背景技術】 【０００２】 化石燃料依存からの脱却を目指して、エネルギー物質の持続可能な生産技術の開発が世界中で進められている。その中で、遺伝子組み換え微生物を用いた遊離脂肪酸（Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ：以下、ＦＦＡともいう）の細胞外生産系が注目されている。細胞外生産系では、生産されたＦＦＡが菌体外に放出され、細胞を破壊することなくＦＦＡを取り出すことができるため、生産量を飛躍的に増加できると期待されている。そのため、これまでに大腸菌、酵母、シアノバクテリアといった様々な微生物を材料にして、ＦＦＡを細胞外へと放出する遺伝子組み換え株が作製されている（非特許文献１～３）。 【０００３】 藻類による遊離脂肪酸の製造が、光合成により水と二酸化炭素から脂肪酸を製造することができるため食料生産と競合せず、また、単位面積あたりの脂肪酸の生産量が多いため注目されている。 例えば、非特許文献４には、シアノバクテリアの一種である、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２、以下、７９４２株ともいう）のＳＰｃ株由来で、遺伝子操作によって内在性のアシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損と大腸菌由来のアシルＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（｀ｔｅｓＡ）を導入したＦＦＡ生産能に優れたｄＡＳ１Ｔ株が提案されている。 非特許文献５には、７９４２株の硝酸イオン輸送体欠損株であるＮＡ３を親株として、アシルＡＣＰ合成酵素（Ａａｓ）の欠損と大腸菌由来のチオエステラーゼ（｀ｔｅｓＡ）を導入したｄＡＳ２Ｔ株に、ＦＦＡを細胞外に排出するためのｒｎｄＡ１Ｂ１を過剰発現するためのプラスミド（ｐＲＮＤ１）を導入した細胞外へのＦＦＡ放出能に優れたｄＡＳ２Ｔ／ｐＲＮＤ１株が提案されている。 特許文献１には、ペルオキシダーゼの発現を促進した脂肪酸又は脂肪酸を構成成分とする脂質の生産性に優れた遊離脂肪酸生産藻類が提案されている。 ここで、遊離脂肪酸生産藻類が、光合成を盛んに行い、脂肪酸を効率的に生産することのできる温度、ｐＨ、光強度等の条件は、当然に他の藻類等の生育にも好ましい条件である。そのため、遊離脂肪酸生産藻類による脂肪酸製造時には、コンタミネーション（他の微生物による汚染）が起こりやすい。そして、コンタミネーションが起こると、他の微生物が栄養源を消費して、遊離脂肪酸生産藻類が利用できる栄養源の割合が少なくなるため、遊離脂肪酸の生産性が低下してしまう。 【先行技術文献】 【特許文献】 【０００４】 特開２０２０－０８０６９８号公報 【非特許文献】 【０００５】 Rebecca M. Lennen., Drew J. Braden., Ryan M. West., James A.Dumesic., Brian F. Pfleger. (2010) A Process for Microbial Hydrocarbon Synthesis: Overproduction of Fatty Acids in Escherichia coli and Catalytic Conversion toAlkanes. Biotechnol Bioeng. June 1; 106(2) Yongjin J. Zhou1., Nicolaas A. Buijs1., Zhiwei Zhu., Jiufu Qin., Verena Siewers., Jens Nielsen. (2016) Production of fatty acid-derived oleochemicals and biofuels by synthetic yeast cell factories. Nat. Commun. 7:11709 Liu, X., Sheng, J. and Curtiss, R. (2011) Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108: 6899-6904. Kato, A., Use, K., Takatani, N., Ikeda, K., Matsuura, M., Kojima, K., Aichi, M., Maeda, S., Omata, T. (2016) Modulation of the balance of fatty acid production and secretion is crucial for enhancement of growth and productivity of the engineered mutant of the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Biotechonol for Biofu. Vol. 9, 91 Kato A, Takatani N, Use K, Uesaka K, Ikeda K, Chang Y, et al. (2015)Identification of a cyanobacterial RND-type efflux system involved in export of free fatty acids. Plant Cell Physiol. 56:2467-77. 【発明の概要】 【発明が解決しようとする課題】 【０００６】 本発明は、遊離脂肪酸の製造を効率的に行うことのできる脂肪酸の製造方法と遺伝子組換え藻類を提供することを課題とする。 【課題を解決するための手段】 【０００７】 本発明の課題を解決するための手段は以下の通りである。 １．遊離脂肪酸生産藻類に、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類を、 ｐＨ９．０以上１２．０以下の条件下で培養して脂肪酸を生産させることを特徴とする脂肪酸の製造方法。 （Ａ）配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、該ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （Ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、該ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 ２．前記遺伝子組換藻類が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）を親株とすることを特徴とする１．に記載の脂肪酸の製造方法。 ３．前記遺伝子組換藻類が、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６４）またはｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６５）であることを特徴とする１．または２．に記載の脂肪酸の製造方法。 ４．遊離脂肪酸生産藻類に、下記（Ａ）、（Ｂ）の両方を導入した遺伝子組換藻類。 （Ａ）配列番号１で表される塩基配列を含みＳｏｄＢをコードするＤＮＡ、または、該ＳｏｄＢをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、スーパーオキシドディムターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 （Ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含みＶｋｔＡをコードするＤＮＡ、または、該ＶｋｔＡをコードするＤＮＡとの塩基配列の同一性が８０％以上であり、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 ５．前記遊離脂肪酸生産藻類が、シネココッカス・エロンガタスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２）に遺伝子組換えを行った藻類であることを特徴とする４．に記載の遺伝子組換藻類。 ６．ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６４）またはｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株（受託番号ＮＩＴＥ ＦＥＲＭ ＢＰ－２２４６５）である遺伝子組換藻類。 【発明の効果】 【０００８】 本発明において使用する遺伝子組換藻類は、遺伝子組換え前と比較して、アルカリ条件下での脂肪酸生産性に優れている。一般的な藻類の至適ｐＨはｐＨ８．０程度であるため、ｐＨ９～１２の範囲内を保つことにより、他の微生物、特に他の藻類によるコンタミネーションの発生を防止することができる。 【図面の簡単な説明】 【０００９】 実験１における、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株とｄＡＳ１Ｔ株を、１８０ｕＥ／ｍ ２ ・ｓの連続光照射下で培養したときの、菌体量（ＯＤ ７３０ ）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。 実験２における、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株とｄＡＳ１Ｔ株を、ｐＨ１０で培養したときの、菌体量（ＯＤ ７３０ ）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。 実験２における、ｄＡＳ１Ｔ＿ＳＶ株とｄＡＳ１Ｔ株を、ｐＨ１１で培養したときの、菌体量（ＯＤ ７３０ ）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。 実験３における、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株とｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株を、ｐＨ１０で培養したときの、菌体量（ＯＤ ７３０ ）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。 実験３における、ｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１＿ＳＶ株とｄＡＳ２Ｔ＿ｐＲＮＤ１株を、ｐＨ１１で培養したときの、菌体量（ＯＤ ７３０ ）と遊離脂肪酸濃度の経時変化を示すグラフ。 【発明を実施するための形態】 【００１０】 ＳｏｄＢは、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３株由来のスーパーオキシドディスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）であり、遺伝子ｓｏｄＢ（配列番号１）にコードされている。ｓｏｄＢの配列情報は、データベースＣｙａｎｏｂａｓｅのｓｌｒ１５１６（https://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?syn:slr1516）に登録されている。 ＶｋｔＡは、過酸化水素耐性菌であるビブリオ・ルモイエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ）由来のカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）であり、遺伝子ｖｋｔＡ（配列番号２）にコードされている。ｖｋｔＡの配列情報は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ番号ＡＢ０３０８２１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/9967435）に登録されている。 （【００１１】以降は省略されています） この特許をJ-PlatPatで参照する
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