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公開番号2024096732
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-07-17
出願番号2024052990,2022074275
出願日2024-03-28,2017-12-05
発明の名称結腸オルガノイドならびにその作製方法および使用方法
出願人チルドレンズホスピタルメディカルセンター
代理人個人
主分類C12N 5/071 20100101AFI20240709BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】大腸炎、結腸癌、ポリポーシス症候群、および/または過敏性腸症候群から選択される疾患に対して有望な治療薬の有効性および/または毒性を決定するために使用され得るヒト結腸オルガノイドを、in vitroで提供する。
【解決手段】ヒト結腸オルガノイド(HCO)であって、前記ヒト結腸オルガノイドは、上皮および間葉を含み、SATB2、MUC2、および/またはMUC5Bを発現する、ヒト結腸オルガノイドを提供する。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
ヒト結腸オルガノイドの形成を誘導する方法であって、
ａ．胚体内胚葉（ＤＥ）をＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲＯＮ／ＧＳＫ２阻害因子）と、前記ＤＥが中後腸スフェロイドを形成するのに十分な期間、接触させるステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の前記中後腸スフェロイドをＢＭＰ活性化因子およびＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子と、前記ヒト結腸オルガノイドを形成するのに十分な期間、接触させるステップとを含み、前記ヒト結腸オルガノイドがＳＡＴＢ２を発現する、方法。
続きを表示（約 1,300 文字）【請求項２】
前記ＤＥが、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後腸細胞またはこれらの組み合わせから選択される前駆細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、小分子ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、タンパク質ベースのＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、タンパク質Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、小分子Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、好ましくは塩化リチウム、２－アミノ－４，６－二置換ピリミジン（ヘテロ）アリールピリミジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＮＳＣ６６８０３６、ＤＣＡベータ－カテニン、２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）－ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジン、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲＯＮ、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＭＰ活性化因子が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ経路を活性化する小分子、ＢＭＰ経路を活性化するタンパク質、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ－１、ベントロモフィン（ｖｅｎｔｒｏｍｏｐｈｉｎ）、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＥが中後腸スフェロイドを形成するのに十分な前記期間が、ステップ（ａ）の前記中後腸スフェロイドによるＣＤＸ２の発現によって決定される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記中後腸スフェロイドが、前記ヒト結腸オルガノイドを形成するのに十分な前記期間、前記ヒト結腸オルガノイドの細胞によるＳＡＴＢ２およびＣＤＸ２の発現による、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＣＯが結腸腸内分泌細胞（ＥＥＣ）の存在を特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＯが陰窩の存在を特徴とし、絨毛を実質的に含まない、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＣＯが結腸特異的杯細胞を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる２０１６年１２月５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４２９，９４８号の利益を主張する。
続きを表示（約 8,900 文字）【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からの胃および小腸のオルガノイドの作製がヒト消化管（ＧＩ）の発生および疾患の研究に革命をもたらしたが、大腸オルガノイドを作製するための尽力は、一部後腸管発生の強固な理解の欠如により、後れを取っている。
【発明の概要】
【０００３】
前駆細胞が胚体内胚葉にｉｎｖｉｔｒｏ分化し、それがシグナル伝達経路の調節を介してヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）へとさらに分化し得る方法が、本明細書に開示される。さらに、ＨＣＯ、およびＨＣＯの使用方法が開示され、例えばＨＣＯについて、大腸炎、結腸癌、ポリポーシス症候群および／または過敏性腸症候群から選択される疾患に対して有望な治療薬の有効性および／または毒性を決定するために使用され得る使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
本出願書類には、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および手数料の支払いにより、官庁により提供されるであろう。
【０００５】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するだろう。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図しない。
【０００６】
Ｂｍｐシグナル伝達は、マウスおよびカエルの胚におけるＳａｔｂ２の発現を調節する。（Ａ）発生中の後腸の周りの核染色を示す胎生８．５日のマウス胚の全載ｐＳｍａｄ１５８（赤色）およびＦｏｘａ２（緑色）染色（ｎ＝６）。（Ｂ）後腸中胚葉および内胚葉におけるｐＳｍａｄ１／５／８染色を示す（Ａ）の囲み領域からの光学組織薄片の挿入図（Ｄ：背側、Ｖ：腹側）。（Ｃ）頭褶期に単離され、ＤＭＨ－１を用いたＢｍｐ阻害の有無の下で２日間培養されたマウス胚の概略図。（Ｄ、Ｅ）培養４８時間後のＤＭＳＯ処置胚（０）およびＤＭＨ－１処置胚（Ｅ）の全載ｐＳｍａｄ１／５／８（赤色）およびＦｏｘａ２（緑色）染色。（Ｆ）ＤＭＳＯまたはＤＭＨ－１の中で培養した胚（１条件あたりｎ＝３の胚）におけるＣｄｘ２に対するｐＳｍａｄ１／５／８およびｐＳｍａｄ２／３染色の定量化（条件当たりｎ＝３胚）。（Ｇ～Ｊ）ＤＭＳＯ（Ｇ、Ｈ）またはＤＭＨ－１（Ｉ、Ｊ）の中での２日間培養の後のマウス胚（各条件につきｎ＝６）のＣｄｘ２（緑色）、Ｓａｔｂ２（赤色）およびＦｏｘａ２（白色）の全載免疫染色。Ｈ～Ｊにおける矢印は、卵黄茎のおおよその位置を指し示す（ＢＡ１、第１腕弓）。（Ｋ）ＤＭＳＯまたはＤＭＨ－１で処置したマウス胚におけるＳａｔｂ２発現の定量化。（Ｌ）Ｘｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ胚におけるＢｍｐ阻害の概略図。ＤＭＳＯ（Ｍ）またはＤＭＨ－１（Ｒ）で処置したＸｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ胚におけるＳａｔｂ２の原位置ハイブリッド形成。（Ｍ）および（Ｒ）における白色の点線は、切片の平面がその後の分析を使用したことを描写する。Ｍｘおよびｍｄ＝第１腕弓の上顎突起および下顎突起。Ｃｂａ＝尾側腕弓。ＤＭＳＯ（Ｎ～Ｑ）またはＤＭＨ－１（Ｓ～Ｖ）で処置したＸｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ胚からのＳａｔｂ２（赤色）、ｐＳｍａｄ１／５／８（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光、および色相併合画像。スケールバーはＧ～Ｈにおいては＝１００μＭ、他のパネルにおいてはすべて５０μ。両側ｔ検定について
＊＊
ｐ＜０．０１および
＊＊＊
ｐ０．００１。
ＢＭＰ２はヒト腸管スフェロイドにおけるＳＡＴＢ２および後側ＨＯＸコードを誘導する。（Ａ）腸管スフェロイドパターン形成プロトコルの概略図。（Ｂ～Ｄ）ノギン（Ｂ）、無処置（Ｃ）およびＢＭＰ２（Ｄ）で１２時間処置したスフェロイドのｐＳＭＡＤ１／５／８（赤色）染色によって測定したＢＭＰシグナル伝達レベル。（Ｅ）陰窩の頂部でのＢＭＰシグナル伝達の上昇を示す成体マウス結腸のｐＳｍａｄ１／５／８染色。（Ｆ～Ｈ）ノギン（Ｆ）、無処置（Ｇ）およびＢＭＰ２（Ｈ）で７２時間処置したスフェロイドにおけるＳＡＴＢ２発現。（Ｉ）パターン形成後のＳＡＴＢ２＋ＣＤＨ１＋上皮の百分率の定量化。（Ｊ）新生スフェロイドおよび３日間のパターン形成後のスフェロイドの主成分分析。（Ｋ）ＢＭＰ処置スフェロイドとＮＯＧ処置スフェロイドとの間で差次的に発現した遺伝子の遺伝子オントロジー分析。（Ｌ）パターン形成前後のスフェロイドのＴＰＭ（１００万当たりの転写産物）値のグラフ。分析した試料は、パターン形成前のスフェロイド（ｎ＝２）、ならびにパターン形成３日後のノギン、対照およびＢＭＰ２で処置したスフェロイドとした（各群につきｎ＝４）。Ｉにおける定量化のために、少なくとも３回の実験由来の２０個のオルガノイドを試験した。エラーバーは標準偏差を表す。スケールバー＝５０ミクロン。
＊＊＊＊
両側ｔ検定によって決定されたｐｓ０．０００１。
部域パターン化形成は、長期間のｉｎｖｉｔｒｏ培養後にヒト腸管オルガノイドにおいて維持される。（Ａ～Ｄ）ノギン、対照、またはＢＭＰ２によるスフェロイドの最初の３日間の処置から結果的に生じた２８日齢オルガノイドの近位マーカーＯＮＥＣＵＴＩ（緑色）を用いた全載免疫蛍光およびＱＰＣＲ分析。ＣＤＸ２（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を用いた染色も使用して、上皮および間葉を検出した。（Ｅ～Ｈ）ＩＦによっておよびＱＰＣＲによって検出された後側マーカーＳＡＴＢ２（赤色）の発現。（Ｉ～Ｌ）ＩＦによるおよびＱＰＣＲによる汎杯細胞マーカーＭＵＣ２（赤色）の分析。（Ｍ～Ｐ）ＩＦによる結腸特異的杯細胞マーカーＭＵＣ５Ｂ（赤色）の分析。ＭＵＣ５Ｂ＋細胞の数を（Ｐ）において定量した。（Ｑ～Ｓ）オルガノイド全体と比較した、単離された間葉系培養物におけるパターン形成マーカーの分析。ノギン、対照、またはＢＭＰ２で処置したオルガノイドに由来するオルガノイド全体におけるおよび間葉系培養物におけるＣＤＨ１（Ｑ）、近位ＨＯＸ遺伝子ＨＯＸＤ３（Ｒ）、および遠位ＨＯＸ遺伝子ＨＯＸＡ１３（Ｓ）のＱＰＣＲ分析ＣＤＨ１は上皮細胞を含有するオルガノイド全体においてのみ観察された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。ＩＦについては、各条件について少なくとも３回の異なる実験から最低１０個のオルガノイドを検討した。ＱＰＣＲについては、２つの別個の実験からの最低５つの生物学的複製物を検討した。スケールバー＝１００ミクロン。両側ｔ検定により決定された＊＊ｐ５０．０１および＊＊＊＊ｐ５０．０００１。
ＨＩＯではなくＨＣＯは、プロエンドクリン転写因子ニューロゲニン３の発現に応答して、結腸特異的腸内分泌細胞を生じた。（Ａ～Ｂ）ＩＰＳＣ７２．３誘導性ＮＥＵＲＯＧ３株を作製するために使用されたドキシサイクリン誘導性ＮＥＵＲＯＧ３レンチウイルスコンストラクトの概略図、およびドキシサイクリン誘導プロトコル。ノギン（Ｃ、Ｆ）、未処置（Ｄ、Ｇ）またはＢＭＰ（Ｅ、Ｈ）を用いてパターン形成された３５日齢のオルガノイドのクロマグラニンＡ（緑色）、ＣＤＸ２（赤色）およびＩＮＳＬ５（白色）による全載染色。（Ｃ～Ｅ）未処置オルガノイド（－Ｄｏｘ）および（Ｆ～Ｈ）発現したＮＥＵＲＯＧ３を有するオルガノイド（＋Ｄｏｘ）。ＥおよびＨにおける挿入図は、ＩＮＳＬ５染色の拡大図を示す。（Ｉ、Ｊ）ＣＨＧＡによって測定されるような（Ｉ）、およびＩＮＳＬ５（Ｊ）発現についての、ＨＩＯおよびＨＣＯにおける腸内分泌細胞のＮＥＵＲＯＧ３誘導のＱＰＣＲ分析。データは、ノギン（ｎ＝３）、対照（ｎ＝３）またはＢＭＰ（ｎ＝６）処置オルガノイドを用いた２つの異なる実験の代表である。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー＝５０ミクロン。＊両側ｔ検定により決定されたｐ＜０．０５。
ＨＩＯおよびＨＣＯは、生体内移植後の部域同一性を維持した。（Ａ～Ｅ）ヒト空腸および結腸からの生検の、ならびにマウス腎被膜の真下に移植され生体内で８～１０週間成長したノギン由来ＨＩＯ、対照ＨＩＯおよびＢＭＰ２由来ＨＣＯのＨ&Ｅ染色。同じ条件の試料を、近位腸管マーカーＧＡＴＡ４（Ｆ～Ｊ）、遠位腸管マーカーＳＡＴＢ２（Ｋ－０）、パネート細胞マーカーＤＥＦＡＳ（Ｐ～Ｔ）、および結腸特異的杯細胞マーカーＭＵＣ５Ｂ（Ｕ～Ｙ）で染色した。ＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の二重染色は異なるチャネルにおいてだがパネルについては同じスライド上で行ったが（Ｆ～０）、それらは個々の擬似色（赤色）画像として示されていることに留意されたい。ヒト生検についてはｎ＝２である。移植されたノギン処置オルガノイドについてはｎ＝１２、対照オルガノイドについてはｎ＝７、およびＢＭＰ２処置オルガノイドについてはｎ＝１６である。スケールバー＝５０ｐｍ。
生体内成長したオルガノイドは、部域特異的ホルモンを発現する。マウス腎被膜の真下で８～１０週間成長したＨＩＯおよびＨＣＯにおける部域的に発現したホルモン（Ａ～Ｄ）グレリン（ＧＨＲＬ）、モチリン（ＭＬＮ）、（Ｅ～Ｈ）ＧＩＰ、（Ｉ～Ｌ）ＧＬＰ－１、（Ｍ～Ｐ）ＰＹＹおよび（Ｑ～Ｔ）ＩＮＳＬ５の発現分析。近位濃縮ホルモンＧＨＲＬ、ＧＩＰおよびＭＬＮは、ノギンおよび対照ＨＩＯにおいて豊富であった（Ａ～Ｈ）。遠位に濃縮されたホルモンＧＬＰ－１およびＰＹＹは、ＢＭＰ２由来のＨＣＯにおいて豊富であった（１～０）。結腸特異的ホルモンＩＮＳＬ５はＨＣＯ（Ｑ～Ｔ）にのみ存在していた。データは、１条件あたり最低５つの移植オルガノイドを代表している。（Ａ）および（Ｂ）の挿入図は、ＧＨＲＬおよびＭＬＮ二重陽性細胞を示す。（Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｔ）ＧＨＲＬ、ＭＬＮ、ＧＩＰ、ＧＬＰ１、ＰＹＹ、およびＩＮＳＬ５についてのＦＰＫＭ値は、ＲＮＡ配列データからである。ＦＰＫＭ値は、１条件あたり３つの生物学的複製物を表す。スケールバー＝３０ミクロン。
ＨＩＯおよびＨＣＯの全体的な転写分析ならびにヒト小腸および結腸との比較。（Ａ）移植したＨＩＯおよびＨＣＯと比較したヒトの成体および胎児の小腸および結腸の主成分分析。（Ｂ）ヒト成体小腸をＨＩＯと、およびヒト成体結腸をＨＣＯと比較する超幾何中項検査。（Ｃ）ＨＩＯおよびＨＣＯと比較して、ヒト小腸および結腸において差次的に発現した転写物を比較する４方向散布図。
Ｇａｔａ４およびＳａｔｂ２は、小腸および大腸の発生中の離散した部域境界を標識する。（Ａ）卵黄茎における発現境界を示す胎生９．５日マウス胚におけるＧａｔａ４（緑色）およびＳａｔｂ２（赤色）の全載染色（ｎ＝９）。（Ｂ）低Ｇａｔａ４発現および低Ｓａｔｂ２発現の移行帯を示す、胎生１１．５日小腸のＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の発現ドメインを描写するモデル。（Ｃ￢Ｅ）卵黄茎におけるＧａｔａ４の後側境界とＳａｔｂ２の前側境界とを示す胎生１１．５日マウス胚におけるＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の全載染色（ｎ＝３）。（Ｆ～Ｈ）Ｓａｔｂ２発現の前側境界が維持されることを示す胎生１２．５日マウス胚におけるＳａｔｂ２およびＦｏｘａ２の全載染色（ｎ＝３）。（Ｉ）胎生１６．５日マウス胚から単離した近位腸におけるＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の全載染色（ｎ＝６）。（Ｊ）胎生１６．５日マウス胚から単離した回腸および大腸におけるＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の全載染色（ｎ＝６）。（Ｋ）ヒト空腸（ｎ＝２）および（Ｌ）結腸（ｎ＝２）の切片におけるＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の染色。スケールバー＝５０μＭ（Ｂ～Ｄ）および１００１Ａｍ（Ｅ～Ｍ）。（Ｃ）および（Ｆ）における点線は、臍のおおよその位置を標識する。略語：ｙｓ：卵黄茎、ｃｂ：虫垂、ｔｚ：移行帯、ｍｘ：上顎、ｍｄ：第１腕弓の下顎部分、ｔｉ：回腸末端部、ｉｃｊ：回盲移行部。
ＳＡＴＢ２は、ＧＡＴＡ４陰性ヒト小腸および大腸において発現する。ＳＡＴＢ２発現が回腸および大腸全体に存在することを示す、ヒト成体十二指腸、小腸、虫垂、結腸および直腸におけるＳＡＴＢ２染色ヒト成体および胎児腸管試料からの公表されたＲＮＡ配列データからのＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の解析。プロットした試料は、ヒト成体十二指腸（ＨｕＳＩ＿Ｄｕｏ＿Ａ）、ヒト成体回腸～十二指腸（ＨｕＳＩ＿Ｄｉｓｔ＿Ａ）、ヒト成体結腸（ＨｕＣｏｌｏｎ＿Ａ）およびヒト胎児小腸（ＨｕＳＩ＿Ｆ）を含む。（Ｃ）気液界面（ＡＬＩ）中で成長した十二指腸（Ｄｕｏ）、空腸（Ｊｅｊ）、回腸（Ｉｌｅ）、上行結腸（ＡＣ）、横行結腸（ＴＣ）および下行結腸由来の胎児腸管幹細胞に対してＷａｎｇら２０１５によって作成されたマイクロアレイデータからのＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の発現の解析分析）。ｒ２値はＥｘｃｅｌのＣＯＲＲＥＬ関数を用いて決定した。
ＢＭＰは、後側ＨＯＸ遺伝子のＳＨＨ活性化を媒介する。（Ａ）後側ＨＯＸ遺伝子のＳＨＨ媒介活性化の従来モデル。（Ｂ）後側ＨＯＸ遺伝子のＳＨＨ媒介活性化および内胚葉ＨＯＸ遺伝子のＢＭＰ媒介活性化の新たなモデル。（Ｃ）ノギン、対照、平滑化アゴニスト（ＳＡＧ）、またはＢＭＰ２を用いた処置後のＨＯＸ因子のＱＰＣＲ分析。（Ｄ）ＳＡＧにより誘導されたＨＯＸ１３遺伝子のＢＭＰ４依存性活性化のモデル。（Ｅ）３日後の対照、５μＭのＳＡＧ、５μＭのＳＡＧ＋ＮＯＧおよびＢＭＰ２で処置したオルガノイド中のＨＯＸＡ１３のＱＰＣＲ分析。（Ｆ）外因性組換えヒトＢＭＰ２によって誘導されたＨＯＸ１３遺伝子のＳＨＨ非依存的活性化のモデル。（Ｇ）３日後の対照、ＢＭＰ、およびＢＭＰ＋シクロパミンで処置したオルガノイド中のＨＯＸＡ１３のＱＰＣＲ分析（１条件あたりｎ＝６）。
拡張生体内培養は、杯細胞の成熟を可能にする。（Ａ）パターン形成され、次いで再パターン形成されたオルガノイドにおけるＣＤＸ２＋ＳＡＴＢ２＋細胞の百分率の定量。２８日齢オルガノイドにおけるＨＯＸＢ１３（Ｂ）およびＨＯＸＤ１３（Ｃ）のＱＰＣＲ分析。４４日齢のノギン、対照、およびＢＭＰで処置オルガノイドからのＣＤＨ１（緑色）、ＣＤＸ２（赤色）、およびＭＵＣ２（白色）による全載染色（Ｄ～Ｆ）および（Ｇ～１）横断切片染色。（Ｊ～Ｌ）４４日齢のＢＭＰ２処置オルガノイドからの切片の染色。白色の矢印はムチン２を分泌する過程にあった杯細胞を指し示す。ＱＰＣＲについては、２つの別個の実験からの最低５個の生物学的複製物を検討した。ＩＦについては、１条件につき最低１０個のオルガノイドを検討した。スケールバー＝５０ｐｍ。
オルガノイドのＢＭＰパターン形成は、ｉｎｖｉｔｒｏおよび生体内で安定である。（Ａ）ノギン、対照、およびＢＭＰでパターン形成したオルガノイドのオルガノイド生着効率。移植されたパターン形成したオルガノイドにおけるＧＡＴＡ４＋ＣＤＸ２＋細胞（Ｂ）およびＳＡＴＢ２＋ＣＤＸ２＋細胞（Ｃ）の百分率の定量。移植されたオルガノイドにおけるＧＡＴＡ４（Ｄ）ＳＡＴＢ２（Ｅ）ＤＥＦＡＳ（Ｆ）およびＭＵＣＳＢ（Ｇ）のＲＮＡ配列データからのＦＰＫＭ値。（Ｈ～Ｉ）ヒト空腸および結腸の生検（１部域当たりｎ＝２）および（Ｊ～Ｌ）移植されたオルガノイド（１条件当たりｎ＝５）のＭＵＣ２（赤色）染色。スケールバー＝５０ミクロン。
ｉｎｖｉｔｒｏおよび生体内で成長したオルガノイドは、腸管前駆細胞を含有している。ノギン、対照、またはＢＭＰで処置したＨ９－ＬＧＲ５－ＧＦＰ由来オルガノイドからのＣＤＨ１およびＧＦＰの代表的な全載画像（Ａ、Ｆ、Ｋ）および組織薄片画像（Ｂ、Ｇ、Ｌ）。（Ｃ～Ｅ）ノギン、（Ｈ～Ｊ）対照、または（Ｍ～Ｏ）ＢＭＰ２で処置したオルガノイドからの切片に関するＣＤＸ２染色（赤色）およびＳＯＸ９染色（緑色）。ＣＤＸ２およびＬＧＲ５－ＧＦＰ（Ｐ、Ｓ、Ｖ）、ＣＤＸ２およびＳＯＸ９（Ｑ、Ｔ、Ｗ）、ならびにＣＤＨ１およびＫＩ６７（Ｒ、Ｕ、Ｘ）を用いて染色した、ノギン、対照、またはＢＭＰで処置したＨ９－ＬＧＲ５－ＧＦＰオルガノイド由来の生体内オルガノイドの代表的な画像。（Ｙ～Ａ‘）それぞれノギン、対照またはＢＭＰの移植片から誘導されたエンテロイドを示す立体顕微鏡写真。（Ｂ’～Ｄ’）対照エンテロイド（２つの移植片からの１００個超のプールされたエンテロイド）およびＢＭＰ２で処置したコロノイド（１つの移植片からの５０個超のコロノイド）における近位および遠位の遺伝子のＱＰＣＲ分析。スケールバー＝５０μｍ。
リボソームおよび免疫細胞のシグネチャは、移植されたオルガノイドと初代ヒト組織との間に差次的に発現する。（Ａ）パターン形成した移植されたオルガノイドならびにヒト成体および胎児の小腸および結腸の主成分分析。（Ｂ）移植片対ヒト初代組織において上方調節された遺伝子の遺伝子オントロジー分析。（Ｃ）ヒト初代組織対移植片において上方調節された遺伝子の遺伝子オントロジー分析。
（Ａ）マトリゲル中での１５日間の成長後のＨＣＯの全載免疫蛍光染色。ＨＣＯ培養物を内皮マーカーＣＤ３１（緑色）および後腸上皮マーカーＣＤＸ２（赤色）について染色した。造血細胞マーカーＰＵ．１についても培養物を染色した（赤色の右側のパネル）。（Ｂ）造血前駆細胞アッセイの概略図。細胞をＨＣＯから収集し、遠心分離し、ギムザ・ライト染色を用いて染色するか、またはＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地中に播種して造血細胞の分化についてアッセイした。（Ｃ）マクロファージ、好中球、好塩基球および好酸球への分化と一致する形態学的特徴を有する、ギムザ・ライト染色した細胞の代表的な画像。（Ｄ）Ｍｅｔｈｏｃｕｌ中で１４日後に形成されたコロニーの代表的な画像。赤血球、マクロファージおよび顆粒球のコロニーは、ＨＣＯで誘導された細胞には存在したが、ノギン処置したＨＩＯで誘導された細胞には存在しなかった。
（Ａ）ヒト結腸生検またはマトリゲル中で２８日間成長させたＨＣＯの免疫蛍光染色。マクロファージのマーカーであるＣＤ６８について染色を行った。（Ｂ）ＨＩＯおよびＨＣＯにおけるＣＤ１４およびＣＤ１６のＣＹＴＯＦ分析のプロット。わずかな百分率のＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋細胞がＨＣＯ中に存在する（青色の正方形）が、ＨＩＯには存在しない。さらに、ＣＤ１６単一陽性細胞がＨＣＯ中に存在しており、このことは単球が培養物内で存在することを示唆した。（Ｃ）１４日齢および２８日齢のＨＩＯおよびＨＣＯから収集した上清のＬｕｍｉｎｅｘアレイ分析。ＩＬ６およびＩＬ８は、２８日齢のＨＣＯ（ＢＭＰ）においては検出されたが、ＨＩＯにおいては検出されなかった。（Ｄ）１４日齢および２８日齢のＨＩＯおよびＨＣＯから収集した上清のＬｕｍｉｎｅｘアレイ分析。マクロファージ特異的サイトカインＭＩＰ１ＡおよびＭＩＰ１Ｂは１４日齢および２８日齢のＨＣＯ（ＢＭＰ）においては検出されたが、１４日齢または２８日齢のＨＩＯにおいては検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
特に明記しない限り、用語は当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。
【０００８】
「約」もしくは「およそ」という用語は、当業者による決定に従って、例えば、測定システムの制限の、その値がどのように測定され、または、決定されるかに依存する、特定の値に対して許容できる誤差範囲内にあることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における実務に従って、１以上の標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、与えられた値の２０％まで、または１０％まで、または５％まで、または１％までの範囲であることを意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【０００９】
本明細書中で使用されるとき、用語「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）は、胚性細胞型および胚体外細胞型に分化することのできる幹細胞である。このような細胞は完全な生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は卵細胞と精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生された細胞も全能性である。
【００１０】
本明細書で使用されるとき、ＰＳ細胞としても一般的に知られている用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」は、ほぼすべての細胞、すなわち、内胚葉（胃の内部の裏うち、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、腎尿路生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）のうちのいずれかから誘導される細胞、へ分化することができるあらゆる細胞を包含する。ＰＳＣは、胚性幹細胞（胚性生殖細胞を含む）から誘導されるか、またはある特定の遺伝子の発現を強制することによって成体体細胞のような非多能性細胞の誘導を通じて得られる、全能性細胞の子孫であり得る。
（【００１１】以降は省略されています）

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