特許ウォッチ

公開番号2024093429
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-07-09
出願番号2022209803
出願日2022-12-27
発明の名称核酸のライブラリー調製方法
出願人花王株式会社
代理人弁理士法人アルガ特許事務所
主分類C12N 15/11 20060101AFI20240702BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】核酸のライブラリーを調製する方法の提供。
【解決手段】ライブラリー調製方法であって、同一サンプルRNAから逆転写及びPCRにより得られるPCR産物を複数準備すること、及び該複数のPCR産物を混合してPCR産物のプールを調製すること、を含む、方法。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
ライブラリー調製方法であって、
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
続きを表示（約 260 文字）【請求項２】
前記サンプルＲＮＡの濃度が、前記逆転写に供するＲＮＡ濃度として、１００ｐｇ／μＬ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルＲＮＡが、分解が進行したＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１～４のいずれか１項記載の方法により調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のライブラリー調製方法に関する。
続きを表示（約 1,900 文字）【背景技術】
【０００２】
マルチプレックスＰＣＲは、複数のプライマー対を同時に使用したＰＣＲ反応により、１つのＤＮＡサンプルから複数の領域を同時に増幅する方法である。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）反応をマルチプレックスＰＣＲと組み合わせたマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲは、遺伝子発現解析やジェノタイピングなどのためのライブラリー調製に利用されている。遺伝子発現解析においては、試料中の特定のＲＮＡの濃度及び／又は相対的もしくは絶対的な量が決定され、特定のＲＮＡが定量化（定量）される。この場合には、精度が高く、再現性がある方法が望まれる。
【０００３】
しかしながら、微量なＲＮＡを用いた核酸増幅反応では、プライマーダイマーの形成や非特異的な増幅が生じ、ＰＣＲ反応効率に偏りが生じやすい（ＰＣＲバイアス）。特に、複数の領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲにおいて、感度や特異度、増幅の優先性にも影響を及ぼす為、上述するＰＣＲバイアスが原因となり、シーケンス解析をはじめとする種々のダウンストリーム解析の精度、及び再現性が低減する場合がある（非特許文献１－３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
BioMed Research International, Volume 2021, Article ID 6647597, 11 pages (2021)
Journal of Clinical Laboratory Analysis 16:47-51 (2002)
The Journal of Molecular Diagnostics, vol. 7, no. 1, pp. 36-39 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、核酸のライブラリー調製方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＰＣＲを利用する核酸のライブラリー調製において、同一ＲＮＡサンプルに対して、ＲＴ－ＰＣＲ反応を複数準備し、得られた複数のＰＣＲ産物をプールすることで、ＰＣＲバイアスを抑制できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）ライブラリー調製方法であって、
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
２）１）の方法により調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＰＣＲを利用する核酸のライブラリー調製時のＰＣＲバイアスを抑制することができる。本発明は、微量及び／又は分解が進行したＲＮＡサンプルを用いた各種解析（例えば、遺伝子解析、診断など）の感度と精度の向上に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
２０８０２遺伝子を対象としたＬｏｇ
２
（ＲＰＭ＋１）値の散布図。上段に実施例１の方法により取得した結果を、下段に実施例２の方法により取得した結果を示す。左：横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ
２
（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にプールした個々のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ
２
（ＲＰＭ＋１）値の平均値をプロットした散布図。両データを比較し、２倍以上の発現差を認める遺伝子を黒色で表す（｜ＦＣ｜≧２）。中央：横軸にプールした一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ
２
（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にもう一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くデータをプロットした散布図。右：横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ
２
（ＲＰＭ＋１）値、縦軸に初発ＲＮＡ量が１０倍高いライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値をプロットした散布図
ＲＮＡのＲＮａｓｅ７処理濃度とＤＶ２００値の関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
（【００１１】以降は省略されています）

関連特許