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公開番号2024058664
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-25
出願番号2023177936
出願日2023-10-14
発明の名称シアリルTn抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、それら抗体をキメラ抗原受容体の一部として導入する方法、およびそれらキメラ抗原受容体を発現したナチュラルキラー細胞
出願人株式会社スディックスバイオテック
代理人
主分類C12N 15/62 20060101AFI20240418BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】癌は1981年から30年以上日本人の死因の第1位となっている。世界中で、種々の癌に対するマーカー分子や分子標的薬開発のための標的分子の検索が行われているが、癌特異的な蛋白質として使用できるものは限られている。そこで近年、癌特異的に発現する糖鎖が注目されている。
【解決手段】独自の糖鎖ナノテクノロジーとファージディスプレイ法を組み合わせて開発したシアリルTn抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体の遺伝子を、キメラ抗原受容体の一部として遺伝子導入したナチュラルキラー細胞の製造を可能とした。この細胞は肝癌や膵癌などの免疫細胞療法に利用できる。
【選択図】図6
特許請求の範囲【請求項１】
シアリルＴｎ抗原糖鎖発現癌細胞に特異的に結合する一本鎖抗体を抗原認識部位として導入したキメラ抗原受容体を含む、ナチュラルキラー細胞。
続きを表示（約 630 文字）【請求項２】
前記一本鎖抗体は、肝臓癌細胞または膵臓癌細胞に特異的に結合する一本鎖抗体である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項３】
請求項１の一本鎖抗体は、配列番号１から９として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
前記キメラ抗原受容体は、
（ａ）イムノグロブリン重鎖シグナルペプチド、
（ｂ）Ｃ末端にＭｙｃ－ｔａｇを有する、シアリルＴｎ抗原糖鎖発現細胞の細胞表層糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体、
（ｃ）ＣＤ２８由来ヒンジ及び膜貫通蛋白質ドメイン、
（ｄ）シグナル伝達のための４－１ＢＢ細胞内蛋白質ドメイン、および、
（ｅ）シグナル伝達のためのＣＤ３ζＴ細胞受容体ドメイン、
を含み、かつ、前記（ａ）～（ｅ）が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、この順に発現するキメラ抗原受容体である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項５】
配列番号１０、１１、または１２として示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、キメラ抗原受容体。
【請求項６】
請求項４に記載のキメラ抗原受容体をコードする、配列番号１３、１４または１５として示される塩基配列を有する核酸コンストラクト。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸コンストラクトをそれぞれＮＫ－９２ＭＩ細胞に導入したＣＡＲ－ＮＫ細胞。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアリルＴｎ抗原糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体の製造、抗体の遺伝子を導入したキメラ抗原受容体および当該キメラ抗原受容体を導入したナチュラルキラー細胞に関する。
続きを表示（約 1,700 文字）【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、生体内に普遍的に存在する生体分子で、糖蛋白質や糖脂質、プロテオグリカンのような複合糖質の形で存在する。細胞表層の糖鎖は、糖鎖－蛋白質間や糖鎖－糖鎖同士の相互作用を介して、細胞接着や情報伝達、ウイルスや細菌の感染などに関与し、生体内で極めて多様な生理機能を担う。
【０００３】
糖鎖の構造や発現量は、炎症や疾患などの細胞内外の環境変化に応じて、動的に変化することが知られている。細胞が癌化すると、特定の糖鎖の過剰発現や欠損が起きたり、一部が欠損した不完全な構造の糖鎖が出現することがある。また、正常細胞には存在しない糖鎖構造が発現することもある。このように、癌化によって、様々な糖鎖の発現変化が起こる。したがって、癌の進行度や転移性、患者の予後などが糖鎖で予測できると期待されている。
【０００４】
厚労省の統計（日本人対象）では、２０２１年度に１，４３９，８５６人（男：７３８，１４１人、女：７０１，７１５人）が亡くなっており、死因別では、悪性新生物＜腫瘍＞の死亡数は３８，１５０５人（死亡総数に占める割合は２６．５％）、死亡率（人口１０万対）は３１０．７であった。癌は１９８１年から３０年以上日本人の死因の第１位となっている。世界中で、種々の癌に対するマーカー分子の検索が行われているが、癌特異的な蛋白質として使用できるものは限られている。そこで近年、癌特異的に発現する糖鎖が注目されている。
【０００５】
上記の特異的な糖鎖は、癌マーカーとしての利用だけでなく、分子標的薬開発のための標的分子としても利用されている。疾患特異的な糖鎖に対する分子標的薬は、新たな診断薬や医薬品の開発にも繋がることから、近年盛んに研究されている。
【０００６】
一方、抗糖鎖抗体の作製においては、（ｉ）疾患特異的な糖鎖構造の同定が非常に難しいこと、（ｉｉ）糖鎖の抗原性が低く、実験動物に免疫してハイブリドーマを得る従来の手法では抗体の作製が難しいこと、（ｉｉｉ）糖鎖の抗原性を向上させるために、糖脂質への誘導や抗原性の高い蛋白質との複合化などが必要なことなど、技術的に様々な課題があり、簡便且つ効率的に特異性の高い抗糖鎖抗体を作製可能な新たな手法の確立が求められている。
【０００７】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体の抗原結合部位を含む領域であるＦａｂの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）から構成される抗体の一種であり、リンカーペプチドによりＶＨとＶＬ同士がつながった構造を持つ。目的のｓｃＦｖを探索・単離する有効な手法としてファージディスプレイ法があり、ウイルスの一種であるバクテリオファージ表面にｓｃＦｖを提示させ、多数のライブラリーの中から特定の抗原に結合するｓｃＦｖ提示ファージを効率的に選別・濃縮する。得られたｓｃＦｖ提示ファージは、大腸菌の蛋白質発現系を用いて、可溶性のｓｃＦｖを発現させることができ、産生されたｓｃＦｖは、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）等のエピトープタグを用いたアフィニティー精製により、高純度に精製することが出来る。さらには、ＩｇＧ抗体へと誘導出来るため、特異性の高いヒト由来抗体を作製する技術として大きな注目を集めている。
【０００８】
発明者らは、効率的に疾患特異的な糖鎖に対する抗体を得る手法を確立するために、ファージライブラリー法と独自のシュガーチップ技術（特許文献１、２、非特許文献１、２）を用いて、シアリルＴｎ抗原糖鎖に対する抗糖鎖抗体の開発を行ってきた。
【０００９】
シアリルＴｎ抗原糖鎖の構造には、シアル酸成分にＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、またはＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を含有する２種類が見出されている。
【００１０】
Ｎｅｕ５Ａｃ構造を含むＴｎ抗原（Ｎｅｕ５Ａｃ－Ｔｎ）は、ヒトを含む多くの哺乳動物に発現する。正常な細胞にも発現するが、癌細胞では過剰に発現することが知られており、胃癌や卵巣癌の診断マーカーの１つとして既に臨床利用されている（非特許文献３）
（【００１１】以降は省略されています）

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