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公開番号2024052521
公報種別公開特許公報(A)
公開日2024-04-11
出願番号2023114218
出願日2023-07-12
発明の名称L-アミノ酸の製造法
出願人味の素株式会社
代理人弁理士法人秀和特許事務所
主分類C12P 13/14 20060101AFI20240404BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】L-グルタミン酸等のL-アミノ酸の製造法を提供する。
【解決手段】下記(A)～(F)の改変から選択される1つまたはそれ以上の改変を有するように改変されたL-アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地および/または該細菌の菌体よりL-アミノ酸を採取することにより、L-アミノ酸を製造する:
(A)BudAタンパク質の活性が低下する改変;
(B)BudBタンパク質の活性が低下する改変;
(C)BudCタンパク質の活性が低下する改変;
(D)PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変;
(E)PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変;
(F)PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
Ｌ－アミノ酸の製造方法であって、
Ｌ－アミノ酸生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および
前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、
を含み、
前記Ｌ－アミノ酸が、グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸であり、
前記細菌が、下記（A）～（F）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
（A）BudAタンパク質の活性が低下する改変；
（B）BudBタンパク質の活性が低下する改変；
（C）BudCタンパク質の活性が低下する改変；
（D）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
（E）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
（F）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
続きを表示（約 3,200 文字）【請求項２】
前記細菌が、少なくとも、前記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が、少なくとも、前記（A）～（C）の改変を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、少なくとも、前記（D）～（F）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、少なくとも、前記（D）～（F）の改変を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、前記（A）～（F）の改変を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記BudAタンパク質の活性が、budA遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記BudBタンパク質の活性が、budB遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記BudCタンパク質の活性が、budC遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下した、方法。
【請求項８】
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記budA遺伝子の発現が、budA遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記budB遺伝子の発現が、budB遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記budC遺伝子の発現が、budC遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記PAJ_3461遺伝子の発現が、PAJ_3461遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記PAJ_3462遺伝子の発現が、PAJ_3462遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463遺伝子の発現が、PAJ_3463遺伝子の発現調節配列の改変により、低下した、方法。
【請求項９】
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記BudAタンパク質の活性が、budA遺伝子の欠失により、低下し；
前記BudBタンパク質の活性が、budB遺伝子の欠失により、低下し；
前記BudCタンパク質の活性が、budC遺伝子の欠失により、低下し；
前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の欠失により、低下し；
前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の欠失により、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の欠失により、低下した、方法。
【請求項１０】
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記BudAタンパク質が、下記（１ａ）、（１ｂ）、または（１ｃ）に記載のタンパク質であり：
（１ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（１ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質；
（１ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質；
前記BudBタンパク質が、下記（２ａ）、（２ｂ）、または（２ｃ）に記載のタンパク質であり：
（２ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（２ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質；
（２ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質；
前記BudCタンパク質が、下記（３ａ）、（３ｂ）、または（３ｃ）に記載のタンパク質であり：
（３ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（３ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、(S,S)-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、メソ-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、および／また
はダイアセチルレダクターゼ活性を有するタンパク質；
（３ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、(S,S)-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ活性、メソ-2,3-ブタンジオー
ルデヒドロゲナーゼ活性、および／またはダイアセチルレダクターゼ活性を有するタンパク質；
前記PAJ_3461タンパク質が、下記（４ａ）、（４ｂ）、または（４ｃ）に記載のタンパク質であり：
（４ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（４ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（４ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
前記PAJ_3462タンパク質が、下記（５ａ）、（５ｂ）、または（５ｃ）に記載のタンパク質であり：
（５ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（５ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（５ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質が、下記（６ａ）、（６ｂ）、または（６ｃ）に記載のタンパク質である、方法：
（６ａ）配列番号１２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（６ｂ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（６ｃ）配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いた発酵法によるＬ－グルタミン酸等のＬ－アミノ酸の製造法に関する。Ｌ－アミノ酸は、調味料原料等として産業上有用である。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
Ｌ－アミノ酸は、例えば、Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌等の微生物を用いた発酵法により工業生産されている（非特許文献１）。そのような微生物としては、例えば、自然界から分離した菌株やそれらの変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術により微生物のＬ－アミノ酸生産能を向上させることができる。
【０００３】
budA遺伝子にコードされるBudAタンパク質は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（acetolactate decarboxylase）として知られている。budB遺伝子にコードされるBudBタンパク質は、アセト乳酸シンターゼ（acetolactate synthase）として知られている。budC遺伝子にコードされるBudCタンパク質は、(S,S)-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（(S,S)-butanediol dehydrogenase）、メソ-2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（meso-2,3-butandiol dehydrogenase）、またはダイアセチルレダクターゼ（diacetyl reductase）として
知られている。
【０００４】
PAJ_3461遺伝子、PAJ_3462遺伝子、およびPAJ_3463遺伝子にコードされるPAJ_3461タンパク質、PAJ_3462タンパク質、およびPAJ_3463タンパク質は、それぞれ、グルコン酸－２－デヒドロゲナーゼ（gluconate 2-dehydrogenase）を構成するサブユニットとして知ら
れている。
【０００５】
2,3-ブタンジオールの生産能が低下または欠失した微生物を利用して一酸化炭素を炭素源として2-oxogluterate等の物質を製造する技術が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
WO2013/115659
【非特許文献】
【０００７】
明石邦彦ら著アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５～２１５頁、１９８６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細菌のＬ－アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なＬ－アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、下記（A）～（F）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有するように腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を改変することにより同細菌のＬ－アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた：
（A）BudAタンパク質の活性が低下する改変；
（B）BudBタンパク質の活性が低下する改変；
（C）BudCタンパク質の活性が低下する改変；
（D）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
（E）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
（F）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
Ｌ－アミノ酸の製造方法であって、
Ｌ－アミノ酸生産能を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌を培地で培養し、該培地中および／または該細菌の菌体内にＬ－アミノ酸を蓄積すること、および
前記培地および／または前記菌体より前記Ｌ－アミノ酸を採取すること、
を含み、
前記Ｌ－アミノ酸が、グルタミン酸系Ｌ－アミノ酸であり、
前記細菌が、下記（A）～（F）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、方法：
（A）BudAタンパク質の活性が低下する改変；
（B）BudBタンパク質の活性が低下する改変；
（C）BudCタンパク質の活性が低下する改変；
（D）PAJ_3461タンパク質の活性が低下する改変；
（E）PAJ_3462タンパク質の活性が低下する改変；
（F）PAJ_3463タンパク質の活性が低下する改変。
［２］
前記細菌が、少なくとも、前記（A）～（C）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、前記（具体的には、［１］に記載の）方法。
［３］
前記細菌が、少なくとも、前記（A）～（C）の改変を有する、前記（具体的には、［１］または［２］に記載の）方法。
［４］
前記細菌が、少なくとも、前記（D）～（F）の改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有する、前記（具体的には、［１］～［３］のいずれかに記載の）方法。
［５］
前記細菌が、少なくとも、前記（D）～（F）の改変を有する、前記（具体的には、［１］～［４］のいずれかに記載の）方法。
［６］
前記細菌が、前記（A）～（F）の改変を有する、前記（具体的には、［１］～［５］のいずれかに記載の）方法。
［７］
前記（具体的には、［１］～［６］のいずれかに記載の）方法であって、
前記BudAタンパク質の活性が、budA遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記BudBタンパク質の活性が、budB遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記BudCタンパク質の活性が、budC遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；
前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、低下した、方法。
［８］
前記（具体的には、［１］～［７］のいずれかに記載の）方法であって、
前記budA遺伝子の発現が、budA遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記budB遺伝子の発現が、budB遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記budC遺伝子の発現が、budC遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記PAJ_3461遺伝子の発現が、PAJ_3461遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；
前記PAJ_3462遺伝子の発現が、PAJ_3462遺伝子の発現調節配列の改変により、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463遺伝子の発現が、PAJ_3463遺伝子の発現調節配列の改変により、低下した、方法。
［９］
前記（具体的には、［１］～［８］のいずれかに記載の）方法であって、
前記BudAタンパク質の活性が、budA遺伝子の欠失により、低下し；
前記BudBタンパク質の活性が、budB遺伝子の欠失により、低下し；
前記BudCタンパク質の活性が、budC遺伝子の欠失により、低下し；
前記PAJ_3461タンパク質の活性が、PAJ_3461遺伝子の欠失により、低下し；
前記PAJ_3462タンパク質の活性が、PAJ_3462遺伝子の欠失により、低下し；且つ／又は
前記PAJ_3463タンパク質の活性が、PAJ_3463遺伝子の欠失により、低下した、方法。
［１０］
前記（具体的には、［１］～［９］のいずれかに記載の）方法であって、
【発明の効果】
（【００１１】以降は省略されています）

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