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公開番号2025175944
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-12-03
出願番号2025004241
出願日2025-01-10
発明の名称β-グルクロニダーゼ及びその組換え発現ベクター、エンジニアリング菌、発酵剤とグリチルレチン酸の量産方法
出願人北京理工大学
代理人個人
主分類C12N 9/24 20060101AFI20251126BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】高い親和性、酵素活性、触媒効率、形質転換率を求め、18β-GAMG蓄積をより良く低減し、量産に適したβ-グルクロニダーゼという問題を解決する目的で、β-グルクロニダーゼ及びその組換え発現ベクター、エンジニアリング菌、発酵剤とグリチルレチン酸の量産方法を提供すること。
【解決手段】酵素エンジニアリングと微生物技術分野に属する。前記β-グルクロニダーゼは、β-グルクロニダーゼAcGUS、AcGUS1、AcGUS2、AcGUS3、AcGUS3突然変異体から選択され、AcGUSは、特定のアミノ酸が突然変異した酵素である。本発明は、簡単且つ効率的であり、18α-GAと18β-GAを工業的な規模で製造することができる。
【選択図】図7
特許請求の範囲【請求項１】
β－グルクロニダーゼであって、
β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ１、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ２、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３又はβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３突然変異体から選択され、
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＡＥＫ６９３５２．１であるアミノ酸配列の１番目のアミノ酸欠失、７番目のアラニンがグリシンに、６６番目のアルギニンがリシンに、２５６番目のアラニンがバリンに、２７０番目のスレオニンがアラニンに、３３２番目のバリンがフェニルアラニンに、３６３番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、５０６番目のメチオニンがバリンに突然変異した酵素であり、
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ１、ＡｃＧＵＳ２、ＡｃＧＵＳ３は、それぞれβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳの窒素末端から１０、２０、３０個のアミノ酸を切断した酵素であり、前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すとおりであり、
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３突然変異体は、ＡｃＧＵＳ３の４６１番目のグリシンがシステインに突然変異した突然変異体、又はＡｃＧＵＳ３の４６２番目のグルタミンがヒスチジンに突然変異した突然変異体、又はＡｃＧＵＳ３の５７５番目のイソロイシンがリシンに突然変異した突然変異体、又はＡｃＧＵＳ３の４６１番目のグリシンがシステインに、４６２番目のグルタミンがヒスチジンに、及び５７５番目のイソロイシンがリシンに突然変異した突然変異体から選択される
ことを特徴とするβ－グルクロニダーゼ。
続きを表示（約 1,400 文字）【請求項２】
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳの遺伝子配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示すとおりであり、
前記ＡｃＧＵＳ３の４６１番目のグリシンがシステインに、４６２番目のグルタミンがヒスチジンに、５７５番目のイソロイシンがリシンに突然変異した突然変異体は、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３Ｍ１である
請求項１に記載のβ－グルクロニダーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のβ－グルクロニダーゼの遺伝子配列が連結される発現ベクターである
ことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記発現ベクターは、ｐＥＴ２８ａ、ｐＧＡＰＺαＡ、ｐＰＩＣ９Ｋ又はｐＰＩＣＺαから選択される
請求項３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項５】
前記組換え発現ベクターは、組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３又は組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３Ｍ１から選択される
請求項３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項６】
エンジニアリング菌であって、
ピキア酵母菌株ＡｃＧＵＳ３、ピキア酵母菌株ＡｃＧＵＳ３Ｍ１又はピキア酵母菌株ｄＧ－ＧＡ１から選択され、
前記ピキア酵母菌株ＡｃＧＵＳ３は、請求項１又は２に記載のβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３を発現可能であり、
前記ピキア酵母菌株ＡｃＧＵＳ３Ｍ１は、請求項２に記載のβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３Ｍ１を発現可能であり、
前記ピキア酵母菌株ｄＧ－ＧＡ１は、請求項２に記載のβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３Ｍ１及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）菌株Ｌｉ－２０由来のβ－グルクロニダーゼＡｔＧＵＳを同時に発現可能である
ことを特徴とするエンジニアリング菌。
【請求項７】
前記ピキア酵母菌株ＡｃＧＵＳ３は、請求項５に記載の組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３を含む
請求項６に記載のエンジニアリング菌。
【請求項８】
前記ピキア酵母菌株ＡｃＧＵＳ３Ｍ１は、請求項５に記載の組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３Ｍ１を含む
請求項６に記載のエンジニアリング菌。
【請求項９】
前記ピキア酵母菌株ｄＧ－ＧＡ１は、請求項５に記載の組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３Ｍ１が改造された組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３Ｍ１－ＮｒｓＲと、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）菌株Ｌｉ－２０由来のβ－グルクロニダーゼＡｔＧＵＳ遺伝子配列が連結される組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｔＧＵＳとを含み、前記改造とは、組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３Ｍ１のオリジナル発現ベクターｐＧＡＰＺαＡの耐性遺伝子をＮｒｓＲ耐性に置き換えることを指す
請求項６に記載のエンジニアリング菌。
【請求項１０】
発酵活性成分を含む発酵剤であって、前記発酵活性成分は、請求項１または２に記載のβ－グルクロニダーゼ、及び／又は請求項３ないし５のいずれかに記載の組換え発現ベクター、及び／又は請求項６ないし９のいずれかに記載のエンジニアリング菌を含む
ことを特徴とする発酵剤。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素エンジニアリングと微生物技術分野に関し、具体的には、β－グルクロニダーゼ及びその組換え発現ベクター、エンジニアリング菌、発酵剤とグリチルレチン酸の量産方法に関する。
続きを表示（約 2,900 文字）【背景技術】
【０００２】
カンゾウは、伝統的な薬食同源植物として、医薬、食品や化粧品などの業界に広く応用されている。史料の記載によると、カンゾウが薬として使用されるのは、四千年以上の歴史があり、「朝のうち、国老一位、薬のうち、カンゾウ一位」と言える。カンゾウは、解熱解毒をし、脾臓の気を補い、肺を潤し咳を止め、諸薬を調和するなどの効果があるだけではなく、喉の腫れと痛み、脾臓と胃機能の障害、消化性潰瘍などの症状に用いられ、抗炎症、肝保護、抗酸化、抗ウイルス、抗腫瘍と抗利尿などの面では広く応用されている。多くの現代漢方薬の複合処方配合にカンゾウ又はその有効成分が添加されている。
【０００３】
グリチルリチン酸（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃａｃｉｄ、ＧＬ）とグリチルレチン酸（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃａｃｉｄ、ＧＡ）は、それぞれカンゾウの主な成分と活性成分である。現在、報道されたグリチルレチン酸の生産には、主に化学法とバイオトランスフォーメーション法があり、ＣＮ１０１８１７８６７Ａは、グリチルリチン酸塩を原料として、硫酸と高濃度醋酸の触媒でアセチルグリチルレチン酸を生成してから、さらにデアセチル化して、グリチルレチン酸を得、反応には強酸、強塩基と有機溶剤を大量に使用する必要があり、エネルギー消費量が高く、収率が低く、且つエコのストレスが大きいなどの問題があることを報道した。一方、バイオトランスフォーメーション法は、条件が温和で、収率が高く、エコなどの利点を有するだけでなく、異なる誘導体の製造に純度がより高い薬用前駆体を提供することができ、発展の見通しのある工業生産方式である。ＧＡが抗炎症、肝保護、抗酸化、抗ウイルス、抗腫瘍と抗利尿などへの応用はすでに多くの文献で報告されている。研究によると、１８α－ＧＡの肝分布能力が１８β－ＧＡよりも強く、肝炎治療の面で効果がより優れ、副反応が１８β－ＧＡよりも弱く、安全性がより良いと示される。
【０００４】
従来のバイオトランスフォーメーション法の報道では、主にβ－グルクロニダーゼを利用してグリチルリチン酸を加水分解して１８β－ＧＡを生産することをメインとして、グリチルリチン酸基質は、β－グルクロニダーゼの２段階の加水分解作用を得た後に、それぞれ１８α－グリチルレチン酸と１８β－グリチルレチン酸（図１の通り）を得ることができる。発明人の研究グループの先行研究成果である中国発明特許ＣＮ１０９６２８４２７Ｂには、ドメイン置換による組換え酵素ＡｔＧＵＳ－ｍｉｘが報道されており、この組換え酵素は、異なる条件で１８β－ＧＡを生産する場合に、最終濃度は、最大１６．３ｇ／Ｌ、反応サイクル９６ｈであるが、中間体１８β－ＧＡＭＧの蓄積で起こしやすい反応抑製の問題を解決していない。
【０００５】
より高い親和性、酵素活性、触媒効率、形質転換率を求め、１８β－ＧＡＭＧの蓄積をより良く低減し、さらにグリチルレチン酸の生産コストを低減するために、本分野は、グリチルレチン酸の工業化製造に用いる新しいβ－グルクロニダーゼを開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本分野の従来の技術におけるより高い親和性、酵素活性、触媒効率、形質転換率を求め、１８β－ＧＡＭＧ蓄積をより良く低減し、量産に適したβ－グルクロニダーゼという問題を解決する目的で、本発明は、β－グルクロニダーゼ及びその組換え発現ベクター、エンジニアリング菌、発酵剤とグリチルレチン酸の量産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の技術方案は、以下の通りである：
β－グルクロニダーゼであって、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ、及び／又はβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ１、及び／又はβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ２、及び／又はβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３、及び／又はβ－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３突然変異体から選択され、
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＡＥＫ６９３５２．１であるアミノ酸配列の１番目のアミノ酸欠失、７番目のアラニンがグリシンに、６６番目のアルギニンがリシンに、２５６番目のアラニンがバリンに、２７０番目のスレオニンがアラニンに、３３２番目のバリンがフェニルアラニンに、３６３番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に、５０６番目のメチオニンがバリンに突然変異した酵素であり、
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ１、ＡｃＧＵＳ２、ＡｃＧＵＳ３は、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳの窒素末端の１－３９個のアミノ酸を切断した酵素であり、
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３突然変異体は、ＡｃＧＵＳ３の４６１番目のグリシンがシステインに突然変異した突然変異体、又はＡｃＧＵＳ３の４６２番目のグルタミンがヒスチジンに突然変異した突然変異体、又はＡｃＧＵＳ３の５７５番目のイソロイシンがリシンに突然変異した突然変異体、又はＡｃＧＵＳ３の４６１番目のグリシンがシステインに、４６２番目のグルタミンがヒスチジンに、及び５７５番目のイソロイシンがリシンに突然変異した突然変異体から選択される。
【０００８】
前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳのアミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ．１に示し、
好ましくは、前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳの遺伝子配列をＳＥＱＩＤＮＯ．２に示し、
好ましくは、前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ１は、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳの窒素末端の１０個のアミノ酸を切断した酵素であり、
好ましくは、前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ２は、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳの窒素末端の２０個のアミノ酸を切断した酵素であり、
好ましくは、前記β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３は、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳの窒素末端の３０個のアミノ酸を切断した酵素であり、
好ましくは、前記ＡｃＧＵＳ３の４６１番目のグリシンがシステインに、４６２番目のグルタミンがヒスチジンに、及び５７５番目のイソロイシンがリシンに突然変異した突然変異体は、β－グルクロニダーゼＡｃＧＵＳ３Ｍ１である。
【０００９】
組換え発現ベクターであって、前記のβ－グルクロニダーゼの遺伝子配列の発現ベクターに連結される。
【００１０】
前記発現ベクターは、ｐＥＴ２８ａ、ｐＧＡＰＺαＡ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺαから選択され、
好ましくは、前記組換え発現ベクターは、組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ、及び／又は組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３、及び／又は組換え発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ－ＡｃＧＵＳ３Ｍ１から選択される。
（【００１１】以降は省略されています）

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