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公開番号2025172266
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-21
出願番号2025134723,2022507848
出願日2025-08-13,2020-09-16
発明の名称高剪断可溶化を介してスパイダーシルクタンパク質を単離するための方法
出願人ボルトスレッズインコーポレイテッド
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C07K 1/14 20060101AFI20251114BHJP(有機化学)
要約【課題】組換えスパイダーシルクポリペプチドを精製して溶解性を高め、そして、シルクタンパク質の回収率を高める改善した方法、および組換えスパイダーシルクタンパク質を含む組成物を提供する。
【解決手段】組換えスパイダーシルクタンパク質を宿主細胞から単離する方法であって、以下の工程を含む、方法:a.組換えスパイダーシルクタンパク質を含む不溶性物質を提供する工程;b.前記不溶性物質を、溶媒を含む水溶液に加える工程;c.前記不溶性物質を含む前記水溶液に対して剪断力を印加する工程であって、それにより、前記組換えスパイダーシルクタンパク質を前記水溶液に可溶化させる、工程を含む、前記方法が提供される。
【選択図】図1A
特許請求の範囲【請求項１】
組換えスパイダーシルクタンパク質を宿主細胞から単離する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ．組換えスパイダーシルクタンパク質を含む不溶性物質を提供する工程；
ｂ．前記不溶性物質を、溶媒を含む水溶液に加える工程；
ｃ．前記不溶性物質を含む前記水溶液に対して剪断力を印加する工程であって、それにより、前記組換えスパイダーシルクタンパク質を前記水溶液に可溶化させる、工程
を含む、前記方法。
続きを表示（約 660 文字）【請求項２】
前記剪断力が、マイクロ流動化を介して印加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロ流動化により、約６×１０
６
ｓ
－１
～１０×１０
６
ｓ
－１
の剪断速度が生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロ流動化により、少なくとも約６×１０
６
ｓ
－１
の剪断速度が生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロ流動化により、少なくとも約１０×１０
６
ｓ
－１
の剪断速度が生じる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロ流動化が、２０，０００ｐｓｉ～３０，０００ｐｓｉで実施される、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロ流動化が、３０，０００ｐｓｉで実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マイクロ流動化が、２３，０００ｐｓｉで実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
マイクロフルイダイザーＭ－１１０ＰまたはＬＭ１０マイクロフルイダイザー、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロフルイダイザーが、Ｇ１０Ｚインタラクションチャンバーを含む、請求項９に記載の方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１６日に出願した米国仮出願第６２／９０１，０５３号の利益を主張しており、この出願の全内容を、参照により、本明細書で援用する。
続きを表示（約 2,300 文字）【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－ウェブを介して提出をした配列表を含んでおり、そして、その全内容を本明細書で援用する。２０２０年９月１６日に作成した当該ＡＳＣＩＩコピーには、ＢＴＴ－０３３ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔの名称を付しており、そして、５０，９６０バイトの大きさである。
【背景技術】
【０００３】
背景
クモのシルクポリペプチドは、大きな（＞１５０ｋＤａ、＞１０００アミノ酸）ポリペプチドであり、３つのドメイン：Ｎ末端非反復ドメイン（ＮＴＤ）、反復ドメイン（ＲＥＰ）、及びＣ末端非反復ドメイン（ＣＴＤ）に分けることができる。ＮＴＤ及びＣＴＤは、比較的小さく（それぞれ、約１５０、約１００アミノ酸）、十分に研究が行われており、そして、ポリペプチドに対して、水安定性、ｐＨ感受性を付与し、また、凝集時には分子を整列させるものと考えられている。また、ＮＴＤは、強力な予測分泌タグを有しており、このものは、異種発現の間に除去されることが多い。天然ポリペプチドの約９０％が反復領域であり、また、シルク繊維にそれぞれ強度と可撓性を付与する結晶領域とアモルファス領域へと折り畳まれている。
【０００４】
シルクポリペプチドは、ミツバチ、ガ、クモ、ダニ、その他の節足動物など、様々な供給源に由来する。一部の生物は、独特の配列、構造要素、及び機械的特性を備えた複数のシルク繊維を作り出す。例えば、ナガコガネグモは、６つの独特なタイプの腺を有しており、そこから、様々なシルクポリペプチド配列を生成して、環境またはライフサイクルの節目に適合するように調整した繊維を重合する。これらの繊維は、それらが由来する腺に鑑みて名称が付いており、また、ポリペプチドは、腺の略語（例えば、「Mａ」）、及びｓｐｉｄｒｏｉｎ（ｓｐｉｄｅｒｆｉｂｒｏｉｎの省略形）に関する「Ｓｐ」で標識している。ナガコガネグモでは、これらのタイプとして、ＭａｊｏｒＡｍｐｕｌｌａｔｅ（ＭａＳｐ，別名、ドラグライン）、ＭｉｎｏｒＡｍｐｕｌｌａｔｅ（ＭｉＳｐ）、Ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ）、Ａｃｉｎｉｆｏｒｍ（ＡｃＳｐ）、Ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ（ＴｕＳｐ）、及びＰｙｒｉｆｏｒｍ（ＰｙＳｐ）がある。繊維の種類、ドメイン、及び生物の異なる属及び種の間での変化を鑑みれば、これらポリペプチド配列の組み合わせは、組換え繊維の商業的生産に利用可能な膨大な数の潜在的特質をもたらす。今日まで、組換えシルクを使用した研究の大部分は、ＭａｊｏｒＡｍｐｕｌｌａｔｅＳｐｉｄｒｏｉｎ（ＭａＳｐ）に焦点をあてたものであった。
【０００５】
現在のところ、組換えシルク繊維は市販されておらず、また、いくつかの例外を除いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）やその他のグラム陰性原核生物を別とすれば、微生物が産生することはない。これまでに生産されてきた組換えシルクは、主に、重合した短いシルク配列モチーフまたはネイティブ反復ドメインの断片のいずれかから構成されており、ＮＴＤ及び／またはＣＴを併用することもある。
【０００６】
しかしながら、一部の事例では、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、製造及び精製の間に望ましくない不溶性の凝集体を形成する。凝集を起こして、β－シート構造を形成する能力が故に、シルク配列に基づいたタンパク質の可溶化は困難である。これらのタンパク質の可溶化には、モル濃度の大きなカオトロープ溶液など、生物学的分子に不向きな化学的条件を必要とすることが多い。精製の間にペプチドを再可溶化する方法は、タンパク質の分解を招くことがよくあり、その結果、収率が低く、そして、靱性が貧弱であり、また、手触りが良くない繊維の生成が避けられない。したがって、これらのポリペプチドを精製して溶解性を高め、そして、シルクタンパク質の回収率を高める改善した方法が待望されている。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書では、様々なカオトロープ溶液を含む化学的溶媒和が不十分である条件において、大きな物理的エネルギー、例えば、高エネルギー流体処理装置によって生じる、剪断、衝撃、及びキャビテーションなど、を与えてシルクタンパク質を可溶化する方法を提供する。
【０００８】
要約
ある態様では、本明細書では、組換えスパイダーシルクタンパク質を宿主細胞から単離する方法を提供しており、当該方法は、以下の工程を含む：組換えスパイダーシルクタンパク質を含む不溶性物質を提供する工程；当該不溶性物質を、溶媒を含む水溶液に加える工程；当該不溶性物質を含む当該水溶液に対して剪断力を印加する工程であって、それにより、当該組換えスパイダーシルクタンパク質を当該水溶液に可溶化させる、工程。
【０００９】
一部の実施形態では、当該剪断力が、マイクロ流動化を介して印加される。
【００１０】
一部の実施形態では、当該マイクロ流動化により、約６×１０
６
ｓ
－１
～１０×１０
６
ｓ
－１
の剪断速度が生じる。一部の実施形態では、当該マイクロ流動化により、少なくとも約６×１０
６
ｓ
－１
の剪断速度が生じる。一部の実施形態では、当該マイクロ流動化により、少なくとも約１０×１０
６
ｓ
－１
の剪断速度が生じる。
（【００１１】以降は省略されています）

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