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公開番号2025170359
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-18
出願番号2025139179,2023503189
出願日2025-08-22,2020-07-17
発明の名称高活性トランスポゾン及びトランスポザーゼ
出願人プロバイオジェンアーゲー
代理人弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
主分類C12N 9/12 20060101AFI20251111BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】より活性の高いトランスポゾン又はトランスポザーゼを提供する。
【解決手段】本発明は、少なくとも1つのアミノ酸置換を含むpiggyBacトランスポザーゼ又はトランスポザーゼ機能を有するその断片若しくは誘導体を含むポリペプチドに関する。さらに、本発明は、piggyBac又はpiggyBac様左反復配列及び左内部反復配列を含むトランスポーザブルエレメントであって、左内部反復配列が少なくとも1つのヌクレオチド改変を含むトランスポーザブルエレメントに関する。さらに、本発明は、上記のトランスポザーゼ及び/又はトランスポーザブルエレメントを含むキットに関する。さらに、本発明は、上記のトランスポザーゼ及び/又はトランスポーザブルエレメントを含むターゲティングシステムに関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
下記からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ又はトランスポザーゼ機能を有するその断片若しくは誘導体を含むポリペプチド。
アミノ酸位置３０又はそれに対応するアミノ酸位置のイソロイシン（Ｉ）を、アラニン（Ａ）により置換（Ｉ３０Ａ）、
アミノ酸位置１１８又はそれに対応するアミノ酸位置のグルタミン（Ｑ）を、プロリン（Ｐ）により置換（Ｑ１１８Ｐ）、
アミノ酸位置１８５又はそれに対応するアミノ酸位置のメチオニン（Ｍ）を、バリン（Ｖ）により置換（Ｍ１８５Ｖ）、
アミノ酸位置２８２又はそれに対応するアミノ酸位置のメチオニン（Ｍ）を、ロイシン（Ｌ）により置換（Ｍ２８２Ｌ）、並びに
アミノ酸位置５３８又はそれに対応するアミノ酸位置のアスパラギン（Ｎ）を、アルギニン（Ｒ）により置換（Ｎ５３８Ｒ）。
続きを表示（約 2,500 文字）【請求項２】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ又はトランスポザーゼ機能を有するその断片若しくは誘導体が以下のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
アミノ酸位置３０又はそれに対応するアミノ酸位置のイソロイシン（Ｉ）を、アラニン（Ａ）により置換（Ｉ３０Ａ）、
アミノ酸位置２８２又はそれに対応するアミノ酸位置のメチオニン（Ｍ）を、ロイシン（Ｌ）により置換（Ｍ２８２Ｌ）、並びに
アミノ酸位置５３８又はそれに対応するアミノ酸位置のアスパラギン（Ｎ）を、アルギニン（Ｒ）により置換（Ｎ５３８Ｒ）。
【請求項３】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ又はトランスポザーゼ機能を有するその断片若しくは誘導体が以下のアミノ酸置換を含む、請求項１又は請求項２に記載のポリペプチド。
アミノ酸位置３０又はそれに対応するアミノ酸位置のイソロイシン（Ｉ）を、アラニン（Ａ）により置換（Ｉ３０Ａ）、
アミノ酸位置１１８又はそれに対応するアミノ酸位置のグルタミン（Ｑ）を、プロリン（Ｐ）により置換（Ｑ１１８Ｐ）、
アミノ酸位置１８５又はそれに対応するアミノ酸位置のメチオニン（Ｍ）を、バリン（Ｖ）により置換（Ｍ１８５Ｖ）、
アミノ酸位置２８２又はそれに対応するアミノ酸位置のメチオニン（Ｍ）を、ロイシン（Ｌ）により置換（Ｍ２８２Ｌ）、並びに
アミノ酸位置５３８又はそれに対応するアミノ酸位置のアスパラギン（Ｎ）を、アルギニン（Ｒ）より置換（Ｎ５３８Ｒ）。
【請求項４】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有し、且つ
アミノ酸位置３０のイソロイシン（Ｉ）をアラニン（Ａ）により置換（Ｉ３０Ａ）、
アミノ酸位置１１８のグルタミン（Ｑ）をプロリン（Ｐ）により置換（Ｑ１１８Ｐ）、
アミノ酸位置１８５のメチオニン（Ｍ）をバリン（Ｖ）により置換（Ｍ１８５Ｖ）、
アミノ酸位置２８２のメチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）により置換（Ｍ２８２Ｌ）、並びに
アミノ酸位置５３８のアスパラギン（Ｎ）をアルギニン（Ｒ）により置換（Ｎ５３８Ｒ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含むか、又は
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、前記アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるその変異体であって、該変異体が
アミノ酸位置３０又はそれに対応するアミノ酸位置のイソロイシン（Ｉ）を、アラニン（Ａ）により置換（Ｉ３０Ａ）、
アミノ酸位置１１８又はそれに対応するアミノ酸位置のグルタミン（Ｑ）を、プロリン（Ｐ）により置換（Ｑ１１８Ｐ）、
アミノ酸位置１８５又はそれに対応するアミノ酸位置のメチオニン（Ｍ）を、バリン（Ｖ）により置換（Ｍ１８５Ｖ）、
アミノ酸位置２８２又はそれに対応するアミノ酸位置のメチオニン（Ｍ）を、ロイシン（Ｌ）により置換（Ｍ２８２Ｌ）、並びに
アミノ酸位置５３８又はそれに対応するアミノ酸位置のアスパラギン（Ｎ）を、アルギニン（Ｒ）により置換（Ｎ５３８Ｒ）
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１乃至請求項３のうちいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、
アミノ酸位置３０にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２８２にロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置５３８にアルギニン（Ｒ）を含む配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するか、又は
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、前記アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるその変異体であり、該変異体が、アミノ酸位置３０又はそれに対応するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置２８２又はそれに対応するアミノ酸位置にロイシン（Ｌ）、並びにアミノ酸位置５３８又はそれに対応するアミノ酸位置にアルギニン（Ｒ）を含むものである、請求項１乃至請求項４のうちいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、
アミノ酸位置３０にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置１１８にプロリン（Ｐ）、アミノ酸位置１８５にバリン（Ｖ）、アミノ酸位置２８２にロイシン（Ｌ）及びアミノ酸位置５３８にアルギニン（Ｒ）を含む配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するか、又は
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼが、前記アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるその変異体であり、該変異体が、アミノ酸位置３０又はそれに対応するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）、アミノ酸位置１１８又はそれに対応するアミノ酸位置にプロリン（Ｐ）、アミノ酸位置１８５又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸バリン（Ｖ）、アミノ酸位置２８２又はそれに対応するアミノ酸位置にロイシン（Ｌ）、並びにアミノ酸位置５３８又はそれに対応するアミノ酸位置にアルギニン（Ｒ）を含む、請求項１乃至請求項５のうちいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、少なくとも１つの異種クロマチンリーダードメイン（ＣＲＤ）を含む、請求項１乃至請求項６のうちいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つの異種ＣＲＤが、前記トランスポザーゼ又はトランスポザーゼ機能を有するその断片若しくは誘導体に、好ましくはリンカーを介して連結されている、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ＣＲＤがヒストンメチル化度及び／又はヒストンのアセチル化状態を認識する、請求項７又は請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＣＲＤが植物ホメオドメイン（ＰＨＤ）型ジンクフィンガーである、請求項９に記載のポリペプチド。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ又はトランスポザーゼ機能を有するその断片若しくは誘導体を含むポリペプチドに関する。さらに、本発明は、ｐｉｇｇｙＢａｃ又はｐｉｇｇｙＢａｃ様左反復配列及び左内部反復配列を含むトランスポーザブルエレメントであって、左内部反復配列が少なくとも１つのヌクレオチド改変を含むトランスポーザブルエレメントに関する。さらに、本発明は、上記のトランスポザーゼ及び／又はトランスポーザブルエレメントを含むキットに関する。さらに、本発明は、上記のトランスポザーゼ及び／又はトランスポーザブルエレメントを含むターゲティングシステムに関する。
続きを表示（約 3,200 文字）【背景技術】
【０００２】
トランスポゾンは、最近、強力な非ウイルス性遺伝子送達ツールとして開発されている。特に、プラスミドＤＮＡの組込みがトランスポゾンを用いて支援されるとき、生成されたプロデューサー細胞株の性能を向上させることができる。例えば、トランスポゾンは、より大きなサイズの異種ＤＮＡの組込み及びより多くの異種ＤＮＡコピーの各ゲノムへの組込みを可能にする。さらに、トランスポゾンを介した組込みは、プラスミド骨格の組込みの低減及び／又はコンカテマーの低減のための効率的な方法を提供する。
【０００３】
トランスポーザブルエレメント又はトランスポゾンは、ゲノムのある遺伝子座から別の部分に移動することができるＤＮＡ切片である。トランスポーザブルエレメントの２つのクラス、つまり、ＲＮＡ中間体を介して複製するレトロトランスポゾン（クラス１）と「カットアンドペースト」ＤＮＡトランスポゾン（クラス２）とが区別されている。クラス２トランスポゾンは、短い逆方向末端反復（ＩＴＲ）と、エレメントにコードされた、切出し及び挿入活性を有する酵素であるトランスポザーゼとによって特徴付けられる。天然の構成において、トランスポザーゼ遺伝子は、逆方向反復の間に位置する。クラス２のいくつかのトランスポゾン、例えば、ガのトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ
ｎｉ）由来のトランスポゾン（ＰｉｇｇｙＢａｃ）、コウモリのミオティス・ルシフグス（Ｍｙｏｔｉｓｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）由来のトランスポゾン（ＰｉｇｇｙＢａｔ）、サケ種由来の再構築されたトランスポゾン（ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ）、又はメダカのオリジアス・ラチペス（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ）由来のトランスポゾン（Ｔｏｌ２）は、真核生物のゲノムへの異種ＤＮＡの挿入を促進することが示されている。これらのトランスポゾンは、導入遺伝子送達及び挿入変異誘発を含む、宿主ゲノムの遺伝子操作における多くの用途を有する。例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ＤＮＡトランスポゾン（以前はＩＦＰ２として記載されていた）は、その特性によってベクターと染色体との間で効率的に転移するので、遺伝子工学において技術的に及び商業的に使用されている（米国特許第６２１８１８５号明細書（ＵＳ６２１８１８５））。これらの用途において、組み込まれるＤＮＡの両側には、ＰＢベクター内の２つのＰＢＩＴＲが隣接して配置される。ＰＢトランスポザーゼの共送達により、隣接されたＤＮＡは、ＰＢベクターから正確に切り出され、ＴＴＡＡ特異的部位で標的ゲノムに組み込まれる。
【０００４】
形質転換効率を高めるために、より活性なトランスポザーゼが開発された。これらの高活性トランスポザーゼは、野生型トランスポザーゼと比較して、所与のトランスポゾンが組み込まれた細胞をより大きな割合で、及び細胞あたりのトランスポゾン組込みをより大きな数でもたらす。様々なストラテジーが、当該技術分野において記載されている：例えば、欧州特許第２１６０４６１号明細書（ＥＰ２１６０４６１）は、側方特異的（ｓｉｄｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）変異誘発を介して生成された高活性ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙトランスポザーゼを記載している。米国特許第９５３４２３４号明細書（ＵＳ９５３
４２３４）は、異種核局在化配列（ＮＬＳ）に融合したカイコのボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）由来及びカエルのゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のＰＢ様トランスポザーゼを提供している。欧州特許第１５４６３２２号明細書（ＥＰ１５４６３２２）は、ＤＮＡランディングパッドを認識して、トランスポゾン－トランスポザーゼ複合体をランディングパッドに引き寄せ、その近傍での組込みを促進する結合ドメインを含むキメラ組込み酵素を開示している。欧州特許第１５９４９７２号明細書（ＥＰ１５９４９７２）は、ＤＮＡターゲティングドメインを含む細胞性ポリペプチド又は操作されたポリペプチドと関連することができるポリペプチド結合ドメインに融合したトランスポザーゼ又はトランスポザーゼ機能を有するその断片若しくは誘導体を特許請求する。
【０００５】
形質転換効率はまた、より活性なトランスポゾンを使用することによって増加され得る。
【０００６】
トランスポザーゼの応用分野の１つは、医薬細胞株の開発である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、懸濁培養において増殖するその能力、その複雑な翻訳後修飾の能力、及びヒトウイルス感染に対するその低い感受性に起因して、治療用生物製剤を産生するための最も普及している哺乳動物細胞工場である。
組換え治療用タンパク質の工業的生産の主な限界の１つは、時間と労力を要する細胞株の生産と特性評価プロセスである。利用可能な方法の大部分は、ランダムな導入遺伝子組込みに依存する。複数のカセットは、多くの場合、多かれ少なかれ活性部位にタンデムに組み込まれる。活性のある染色体遺伝子座はまれであり、高プロデューサー細胞を得るためには何千ものクローンをスクリーニングしなければならない。組換え細胞株スクリーニングの範囲を縮小し、組換えＣＨＯ細胞株の生産性と安定性を高めるために、ＰＢを介した遺伝子送達が使用された（Ｍ．Ｍａｔａｓｃｉｅｔａｌ．，ＴｈｅＰｉｇｇｙＢａｃｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆ
ＣＨＯｓｔａｂｌｅｃｅｌｌｌｉｎｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｙｉｅｌｄｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｉｎｅｓｗｉｔｈｓｕｐｅｒｉｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．９，（２０１１））。
【０００７】
しかし、より活性の高いトランスポゾンやトランスポザーゼ（例えば、より活性の高いＰＢやＰＢ様トランスポゾンやトランスポザーゼ）に関しては、（まだ）満足できる結果にはない。
【０００８】
現在の技術水準と比較して細胞当たりより多くの数のトランスポゾン組込みが得られるトランスポゾン及びトランスポザーゼ（例えば、ＰＢ及びＰＢ様トランスポゾン及びトランスポザーゼ）を開発することが非常に望ましい。
【０００９】
最近、Ｍｏｒｅｌｌｅｔらは、ＰＢトランスポザーゼのＣ末端システインリッチドメイン（ＣＲＤ）が、左右のトランスポゾン末端で特定のＤＮＡ配列に結合し、さらに左端で予想外の内部部位に結合することを報告した（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１８，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．５２０１８ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｙ０４４）。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、トランスポーザブルエレメントの左内部反復配列内に人工的に挿入された改変が、トランスフェクタントの選択段階での生存率回復時間を短縮することを見出した。左反復配列に対する左内部反復配列の相同性を増加させる、左内部反復配列内に少なくとも１つの改変を有する人工ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）及びＰＢ様ト
ランスポーザブルエレメントは、当該技術分野において記載も示唆もされていない。このような突然変異が何らかの影響を及ぼすことはありそうもなかった。
（【００１１】以降は省略されています）

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