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公開番号2025169947
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-11-14
出願番号2025129517,2022564431
出願日2025-08-01,2021-04-26
発明の名称ルシフェラーゼ結合免疫吸着アッセイ
出願人アンスティテュ・パストゥール,サントルナショナルドゥラルシェルシュシアンティフィック,アンスティチュート、ナシオナル、ドゥ、ラ、サンテ、エ、ドゥ、ラ、ルシェルシュ、メディカル,INSTITUT NATIONAL DELA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE
代理人個人,個人
主分類C12N 15/62 20060101AFI20251107BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】試料中の免疫グロブリン、この方法において使用する融合タンパク質、並びにこの方法において特に使用可能に特性を向上させた変異ルシフェラーゼを検出するための方法を提供する。
【解決手段】本発明は、ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)又は1本鎖可変断片(scFV)であり、免疫グロブリンに向けられた抗体を含むN末端ドメイン、及びルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、特定のアミノ酸配列を有するか、又は特定のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメインを含む、融合タンパク質に関する。
【選択図】なし
特許請求の範囲【請求項１】
- ラクダ類重鎖抗体(VHH)又は1本鎖可変断片(scFV)の可変ドメインであり、免疫グロブリンに向けられた抗体を含むN末端ドメイン、及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は
- 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメイン
を含む融合タンパク質。
続きを表示（約 970 文字）【請求項２】
ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16及び配列番号17
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
VHHが、免疫グロブリンの定常断片(Fc)に対して生成される、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
抗体がVHHである、請求項1から3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
免疫グロブリンが、アレルゲンに向けられたIgEである、請求項1から4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
免疫グロブリンが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2のN又はSタンパク質に向けられたIgM又はIgGである、請求項1から4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質
を含むキット。
【請求項８】
試料中の免疫グロブリンを検出及び/又は定量するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項９】
(a)試料を、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる工程と、
(b)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
(c)発光を検出する工程と
を含む、試料中の免疫グロブリンの存在を検出するための方法。
【請求項１０】
試料中の免疫グロブリンレベルを定量するための方法であって、
(a)試料を、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる工程と、
(b)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
(c)発光を定量する工程と
を含む、方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の免疫グロブリン、この方法において使用する融合タンパク質、並びにこの方法において特に使用可能に特性を向上させた変異ルシフェラーゼを検出するための方法に関する。
続きを表示（約 3,400 文字）【背景技術】
【０００２】
対象における感染に対する過去又は現在の適応免疫応答のエビデンスを検査するためには、迅速診断検査又は実験室ベースの免疫測定法のいずれかのフォーマットを使用する、感染病原体又はアレルゲンに対する血清学的アッセイを実施しなければならない。
【０００３】
広範な血清学的検査が市場に存在する。例えば、実験室ベースの免疫測定法は、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、化学発光免疫測定法(CLIA)又は電気発光アッセイ(ECL)であり得る。
【０００４】
しかし、血清学的検査にいかなるプロトコールを使用しても、安全性、品質及び性能基準を(分析的及び臨床的感度及び特異性の両方に関して)満たさなければならない。
【０００５】
過去又は現在の感染を示す免疫グロブリンを検出及び/又は定量するための市場の最も標準的な血清学的検査は、高感度であるが、相対的に大量のプラズマを必要とし(幼児を検査する場合に問題となり得る)、また、これらのコスト及び検査結果を分析するための特定の機器の必要性により制限される。したがって、必要とされる試料の容量及びコストを顕著に減少させると同時に、アッセイの堅牢性、再現性及び精度を犠牲とすることなく、血清学的検査の感度を向上させるために、更なる開発が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
国際公開第2018/197727号
国際公開第2012/061530号
国際公開第2014/087010号
米国特許第10,259,886号明細書
【非特許文献】
【０００７】
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Inouye S、Sato J、Sahara-Miura Y、Yoshida S、Hosoya T、Luminescence enhancement of the catalytic 19 kDa protein (KAZ) of Oplophorus luciferase by three amino acid substitutions. Biochem Biophys Res Commun. 2014;445(1):157～162頁
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Hamilton RGら2008
Tsai CTら、2018
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここで出願人は、ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)を、オキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)ルシフェラーゼの触媒ドメインに由来するルシフェラーゼに融合させることによって、ダイナミックレンジの向上及びアッセイ時間の短縮とともに、必要とされる特異性及び感度を維持しながら、試料量の減少下において特定の免疫グロブリンの検出が実施可能であることを見出した。本出願による血清学的アッセイの設計は、迅速診断検査において使用し得る。したがって、目的の任意の感染性疾患だけでなくアレルギー又は自己免疫疾患にも特異的な免疫グロブリンを検出及び/又は定量するために、アッセイを設計することが可能である。
【０００９】
したがって、本発明の主題は、
- ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)又は1本鎖可変断片(scFV)であり、免疫グロブリンに向けられた抗体を含むN末端ドメイン、及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は
- 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメイン
を含む、融合タンパク質である。
【００１０】
また出願人は、この血清学的検査の結果が、NanoKAZルシフェラーゼの特異的変異体を使用すると、それまで以上に向上することを見出した。
（【００１１】以降は省略されています）

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