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公開番号2025152676
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-10-10
出願番号2024054689
出願日2024-03-28
発明の名称フラビウイルスに対するアプタマー及びその使用
出願人国立大学法人東京大学,学校法人早稲田大学
代理人弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
主分類C12N 15/115 20100101AFI20251002BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】フラビウイルスに対する中和分子を提供すること。
【解決手段】配列番号:1に記載のヌクレオチド配列を含む、フラビウイルスに対するアプタマー(但し、配列番号:1に記載のヌクレオチド配列における、3～8番、10～16番、18～22番、24～29番、35～43番、46～47番及び51～54番の部位において、少なくとも1個のヌクレオチドは欠失していてもよい)。
【選択図】なし

特許請求の範囲【請求項１】
配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含む、フラビウイルスに対するアプタマー
（但し、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列における、３～８番、１０～１６番、１８～２２番、２４～２９番、３５～４３番、４６～４７番及び５１～５４番の部位において、少なくとも１個のヌクレオチドは欠失していてもよい。
配列番号：１に記載のヌクレオチド配列における、各Ｔは、独立してチミン又はウラシルを表し、各Ｒは、独立してアデニン又はグアニンを表し、各Ｗは、独立してアデニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｓは、独立してシトシン又はグアニンを表し、各Ｙは、独立してシトシン、チミン又はウラシルを表し、各Ｋは、独立してグアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｖは、独立してアデニン、シトシン又はグアニンを表し、各Ｈは、独立してアデニン、シトシン、チミン又はウラシルを表し、各Ｄは、独立してアデニン、グアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｂは、独立してシトシン、グアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｎは、独立してアデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルを表す）。
続きを表示（約 1,900 文字）【請求項２】
配列番号：２及び３のうちの少なくとも１に記載のヌクレオチド配列を含む、フラビウイルスに対するアプタマー
（但し、配列番号：２に記載のヌクレオチド配列における、３～７番、１０～１６番、１８番、２０～２２番、２４～２９番、３５～４３番、４６～４７番及び５１～５４番の部位において、少なくとも１個のヌクレオチドは欠失していてもよい。配列番号：３に記載のヌクレオチド配列における、１５番、１８番～２１番、２４番及び３４番の部位において、少なくとも１個のヌクレオチドは欠失していてもよい。
配列番号：２及び３に記載のヌクレオチド配列における、各Ｔは、独立してチミン又はウラシルを表し、各Ｒは、独立してアデニン又はグアニンを表し、各Ｗは、独立してアデニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｓは、独立してシトシン又はグアニンを表し、各Ｙは、独立してシトシン、チミン又はウラシルを表し、各Ｖは、独立してアデニン、シトシン又はグアニンを表し、各Ｈは、独立してアデニン、シトシン、チミン又はウラシルを表し、各Ｄは、独立してアデニン、グアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｂは、独立してシトシン、グアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｎは、独立してアデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルを表す）。
【請求項３】
配列番号：４、５、７及び８のうちの少なくとも１に記載のヌクレオチド配列を含む、フラビウイルスに対するアプタマー
（但し、配列番号：４に記載のヌクレオチド配列における、８番、１５番、１６番、２０番及び２１番の部位において、少なくとも１個のヌクレオチドは欠失していてもよい。配列番号：５に記載のヌクレオチド配列における、２０番及び２１番の部位において、少なくとも１個のヌクレオチドは欠失していてもよい。配列番号：７に記載のヌクレオチド配列における、１１番、１２番、１４～１６番、１８～２２番、２４番、２７番、２８番、３５番及び３６番の部位において、少なくとも１個のヌクレオチドは欠失していてもよい。配列番号：８に記載のヌクレオチド配列における、１５番、１８～２０番及び３３番の部位において、少なくとも１個のヌクレオチドは欠失していてもよい。
配列番号：４、５、７及び８に記載のヌクレオチド配列において、各Ｔは、独立してチミン又はウラシルを表し、各Ｍは、独立してアデニン又はシトシンを表し、各Ｒは、独立してアデニン又はグアニンを表し、各Ｗは、独立してアデニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｓは、独立してシトシン又はグアニンを表し、各Ｙは、独立してシトシン、チミン又はウラシルを表し、各Ｋは、独立してグアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｖは、独立してアデニン、シトシン又はグアニンを表し、各Ｈは、独立してアデニン、シトシン、チミン又はウラシルを表し、各Ｄは、独立してアデニン、グアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｂは、独立してシトシン、グアニン、チミン又はウラシルを表し、各Ｎは、独立してアデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルを表す）。
【請求項４】
少なくとも１のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドは、前記各部位のリボースにおいて、独立して、２’位のヒドロキシル基が、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群から選択される原子又は基で置換されているヌクレオチドである、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
配列番号：１に記載のヌクレオチド配列において、１～５番のヌクレオチドと５６～５２番のヌクレオチドとが対合したステム構造、６番及び５１番のヌクレオチドが構成するループ構造、７～８番のヌクレオチドと５０～４９番のヌクレオチドとが対合したステム構造、４８番～４４番のヌクレオチドが構成するループ構造、９～１９番のヌクレオチドと４３～３３番のヌクレオチドとが対合したステム構造（一部バルジアウト残基を含む）、及び、２０番～３２番のヌクレオチドが構成するループ構造をとる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項７】
請求項１～６に記載のアプタマーからなる群から選択される、少なくとも２つのアプタマーが連結してなる、アプタマー多量体。
【請求項８】
請求項１～６に記載のアプタマーからなる群から選択される、少なくとも１つのアプタマーを含む、フラビウイルス感染症の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項９】
前記フラビウイルス感染症が、デングウイルス又は日本脳炎ウイルスの感染症である、請求項８に記載の医薬組成物。

発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルスに対するアプタマー及びその使用（当該アプタマーを含む、フラビウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物等）に関する。
続きを表示（約 2,700 文字）【背景技術】
【０００２】
フラビウイルスは、一本鎖の＋鎖ＲＮＡをゲノムとするエンベロープウイルスであり、７０種以上のウイルスを含み、その殆どは、吸血性節足動物（蚊、ダニ等）によって媒介される。中でも、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、ジカウイルス等は、出血熱、脳炎等の重篤な症状を引き起こすこともあり、世界的に懸念される公衆衛生上の重要な問題となっている。しかしながら、かかるフラビウイルス感染に対する効果的な抗ウイルス薬や特異的な治療法はなく、これらの開発が希求されている。
【０００３】
例えば、デングウイルス（ＤＥＮＶ）の感染は、一過性の熱性疾患であるデング熱のみならず、重篤した場合は致死的なデング出血熱を引き起こす。かかる感染症は、熱帯・亜熱帯地域のみならず、輸入感染によって世界中に拡大しているが、効果的なワクチンや中和抗体の開発は難航している。その主な原因として、抗体依存性の感染増強現象（ＡＤＥ）による症状の重篤化が挙げられる。ＤＥＮＶには４つの血清型（１～４型）が存在し、特定の血清型に対する中和抗体は、異なる血清型に対し交差性を有するものの中和活性を示さない。そればかりか、当該抗体とウイルスとの複合体は、Ｆｃ受容体を有する単球細胞等に効率良く吸着し、感染を促進させ、症状の重篤化を招く。したがって、複数の血清型に対して中和活性を有し、前記重篤化リスクのない中和分子の創製が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
国際公開第２０２１／００６３０５号
【非特許文献】
【０００５】
ＭａｓａｋｉＴａｋａｈａｓｈｉら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、２０２１Ｍａｙ４；１１８（１８）：ｅ２０１９４９７１１８．
ＭａｓａｋｉＴａｋａｈａｓｈｉら、ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．、２０２２Ｊｕｎ２９：２９：９６９－９７８．
ＫｈａｌｉｄＫＡｌａｍら、ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ、２０１５Ｍａｒ３；４（３）：ｅ２３０．
ＲｙｏｇａＩｓｈｉｄａら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２０２０Ａｕｇ２０；４８（１４）：ｅ８２．
ＮａｔｓｕｋｉＩｗａｎｏら、ＮａｔＣｏｍｐｕｔＳｃｉ．、２０２２Ｊｕｎ；２（６）：３７８－３８６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、フラビウイルスに対する中和分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、従前、膜タンパク質に対するアプタマー創製のため、標的膜タンパク質をウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅ，ＶＬＰ）の膜上に発現させた材料を用いたアプタマー選抜法（ＶＬＰ－ＳＥＬＥＸ法、特許文献１、非特許文献１及び２）を開発している。そこで、当該選抜法を基に、デングウイルス様粒子（ＤＥＮＶ－ＶＬＰ）に対し、ＳＥＬＥＸ法の最適化を施した。ＤＥＮＶ－ＶＬＰ以外に特異的に結合する分子をｉｎｓｉｌｉｃｏで効率よく選別するために、ハイスループットシーケンサー（ＨＴＳ）とアプタマーに特化したバイオインフォマティクスソフト（ＦＡＳＴＡｐｔａｍｅｒ、非特許文献３）を用いた統計解析法の最適化を図った。次に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を基盤としたアプタマーとＶＬＰの結合及び中和活性推定技法の確立・最適化を行い、候補配列の結合能と中和能を評価した。その結果、ＤＥＮＶ１～ＤＥＮＶ４までの全血清型のＶＬＰに対して結合するアプタマーを選抜することに成功した。また、配列の短鎖化・最適化、糖鎖修飾を行い、これら改変前と同等以上の結合能を有する配列を得ることにも成功した（ｃａｎｄｉｄａｔｅ１（Ｄ＿２６＿１＿５＿Ｌ＿Ａ１１ＣＵ３８Ｇ）等）。さらに、これらアプタマーは、既存の中和抗体に対して競合阻害性（中和能）を示すことも見出した。
【０００８】
また、上記にて得られたＳＥＬＥＸデータを用い、有力な候補配列の再探索をｉｎｓｉｌｉｃｏ解析により実施した。具体的には、局所的な配列・二次構造を基に有力配列を発掘する解析手法であるＲａｐｔＲａｎｋｅｒ（非特許文献４）、人工知能技術を活用した解析手法であるＲａｐｔＧｅｎ（非特許文献５）を用いて新規のアプタマー候補配列の探索を実施し、高い結合能を有する配列を選抜した。さらに、上記同様、配列の短鎖化・最適化、糖鎖修飾を行い、高い結合能及び中和能を有する配列を更に得ることにも成功した（ｃａｎｄｉｄａｔｅ２（Ｆｒｅｑ＿ｒａｗ５＿ｌｏｇ３＿ｃ２０＿１＿５４＿ｄＵ１５＿Ｃ１６ＧＧ３３Ｕ）等）。
【０００９】
より具体的には、上記ＶＬＰ－ＳＥＬＥＸ法により、ｃａｎｄｉｄａｔｅ１（配列番号：６）とｃａｎｄｉｄａｔｅ２（配列番号：９）を、ＤＥＮＶに対するアプタマーとして同定することに成功した。また、これらを同定する過程において結合活性が確認された全配列の特徴をまとめた結果、ｃａｎｄｉｄａｔｅ１ｓｅｒｉｅｓ（配列番号：５）、ｃａｎｄｉｄａｔｅ２ｓｅｒｉｅｓ（配列番号：８）となることも、本発明者らは明らかにした。さらに、これら２つのヌクレオチド配列を合わせ、ｃａｎｄｉｄａｔｅ１＆２ｓｅｒｉｅｓ（配列番号：３）という共有配列を見出すことも出来た。
【００１０】
また、上記ｃａｎｄｉｄａｔｅ１とｃａｎｄｉｄａｔｅ２を同定するために行ったＤｏｐｅｄ－ＳＥＬＥＸにおいて、結合活性が観察された全配列の特徴をまとめ、ｃａｎｄｉｄａｔｅ１を生成したＤｏｐｅｄ－ＳＥＬＥＸからは、１
ｓｔ
ｄｏｐｅｄ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃａｎｄｉｄａｔｅ１）（配列番号：４）、ｃａｎｄｉｄａｔｅ２を生成したＤｏｐｅｄ－ＳＥＬＥＸからは、２
ｎｄ
ｄｏｐｅｄ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃａｎｄｉｄａｔｅ２）（配列番号：５）という配列的特徴を持つことを、本発明者らは明らかにした。さらに、ｃａｎｄｉｄａｔｅ１とｃａｎｄｉｄａｔｅ２に繋がる上記Ｄｏｐｅｄｌｉｂｒａｒｙを作製するための配列群の同定の際に結合活性が観察された全配列の特徴をまとめ、Ｌｂ０５Ｎ４０（配列番号：２）という共有配列を見出すことが出来た。
（【００１１】以降は省略されています）

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