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公開番号2025134010
公報種別公開特許公報(A)
公開日2025-09-11
出願番号2025119567,2023189736
出願日2025-07-16,2020-06-17
発明の名称所定の構成の複数の発現カセットの標的指向性組込みによって多価二重特異性抗体発現細胞を作製するための方法
出願人エフ. ホフマン-ラロシュアーゲー,F. HOFFMANN-LA ROCHE AKTIENGESELLSCHAFT
代理人個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人,個人
主分類C12P 21/08 20060101AFI20250904BHJP(生化学;ビール;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学)
要約【課題】多価二重特異性抗体を生産するための方法を提供する。
【解決手段】方法は、多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程と、細胞または培養培地から多価二重特異性抗体を回収する工程とを含み、ここで、多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム内に安定して組み込まれており、かつ5’から3’の方向に、第1の重鎖をコードする第1の発現カセット、第1の軽鎖をコードする第2の発現カセット、第1の軽鎖をコードする第3の発現カセット、第2の重鎖をコードする第4の発現カセット、第1の軽鎖をコードする第5の発現カセット、および第1の軽鎖をコードする第6の発現カセットを含む。
【選択図】図1
特許請求の範囲【請求項１】
多価二重特異性抗体を生産するための方法であって、
ａ）前記多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
ｂ）前記細胞または培養培地から前記多価二重特異性抗体を回収する工程
を含み、
前記多価二重特異性抗体をコードする前記デオキシリボ核酸が、前記哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれており、かつ５’から３’の方向に、
（１）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第４の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第５の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
または（２）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第４の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第７の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第８の発現カセット
のいずれかを含む、多価二重特異性抗体を生産するための方法。
続きを表示（約 5,200 文字）【請求項２】
多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸であって、５’から３’の方向に、
（１）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第４の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第５の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
または（２）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第４の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第７の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第８の発現カセット
のいずれかを含む、デオキシリボ核酸。
【請求項３】
哺乳動物細胞における多価二重特異性抗体の発現のためのデオキシリボ核酸の使用であって、前記デオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
（１）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第４の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第５の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
または（２）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第４の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第７の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第８の発現カセット、
のいずれかを含む、使用。
【請求項４】
細胞のゲノムに組み込まれている、多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸を含む、組換え哺乳動物細胞であって、前記多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
（１）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第４の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第５の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
または（２）
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第４の発現カセット、
－第２の重鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第７の発現カセット、および
－前記第１の軽鎖をコードする第８の発現カセット
のいずれかを含む、組換え哺乳動物細胞。
【請求項５】
２つのデオキシリボ核酸を含む組成物であって、前記２つのデオキシリボ核酸が、３つの異なる組換え認識配列および６個または８個の発現カセットを含み、
－第１のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
（１）
－第１の組換え認識配列、
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、および
－第３の組換え認識配列の第１のコピー
または（２）
－第１の組換え認識配列、
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第４の発現カセット、および
－第３の組換え認識配列の第１のコピー
のいずれかを含み、かつ
－第２のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
（１）
－前記第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－第２の重鎖をコードする第４の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、および
－第２の組換え認識配列、
または（２）
－前記第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－第２の重鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第７の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第８の発現カセット、および
－第２の組換え認識配列
のいずれかを含む、組成物。
【請求項６】
多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記多価二重特異性抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
ａ）前記哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２の組換え認識配列、ならびに前記第１の組換え認識配列と前記第２の組換え認識配列との間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ前記組換え認識配列がすべて異なる、哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された前記細胞に、３つの異なる組換え認識配列および６個または８個の発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
－第１のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
（１）
－第１の組換え認識配列、
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、および
－第３の組換え認識配列の第１のコピー
または（２）
－第１の組換え認識配列、
－第１の重鎖をコードする第１の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第２の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第３の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第４の発現カセット、および
－第３の組換え認識配列の第１のコピー
のいずれかを含み、かつ
－第２のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
（１）
－前記第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－第２の重鎖をコードする第４の発現カセット、
－第１の軽鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、および
－第２の組換え認識配列、
または（２）
－前記第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－第２の重鎖をコードする第５の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第６の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第７の発現カセット、
－前記第１の軽鎖をコードする第８の発現カセット、および
－第２の組換え認識配列
のいずれかを含み、
前記第１および前記第２のデオキシリボ核酸の前記第１～前記第３の組換え認識配列が、組み込まれている前記外因性ヌクレオチド配列の前記第１～前記第３の組換え認識配列と一致しており、
１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、前記１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、
２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；
ｃ）１つまたは複数のリコンビナーゼを、
ｉ）ｂ）の前記第１および前記第２のデオキシリボ核酸と同時に、または
ｉｉ）その後で逐次的に
のいずれかで導入する工程であって、
前記１つまたは複数のリコンビナーゼが、前記第１および前記第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する（かつ、任意で、前記１つまたは複数のリコンビナーゼが、２つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、
１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程；ならびに
ｄ）前記第２の選択マーカーを発現しかつ前記多価二重特異性抗体を分泌する細胞を選択する工程
を含み、それにより、前記多価二重特異性抗体をコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記多価二重特異性抗体を分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、
組換え哺乳動物細胞を生産するための方法。
【請求項７】
前記第１の重鎖がＣＨ３ドメイン内に変異Ｔ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔによるナンバリング）を含み、かつ前記第２の重鎖がＣＨ３ドメイン内に変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔによるナンバリング）を含むか、またはその逆である、請求項１から６のいずれか一項に記載の、多価二重特異性抗体を生産するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を生産するための方法。
【請求項８】
前記重鎖のうちの１つが変異Ｓ３５４Ｃをさらに含み、それぞれの他の重鎖が変異Ｙ３４９Ｃ（Ｋａｂａｔによるナンバリング）を含む、請求項７に記載の、多価二重特異性抗体を生産するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を生産するための方法。
【請求項９】
前記第１の軽鎖が、ドメイン交換された軽鎖ＶＨ－ＶＬまたはＣＨ１－ＣＬである、請求項１から８のいずれか一項に記載の、多価二重特異性抗体を生産するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を生産するための方法。
【請求項１０】
－前記第１の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および第１の軽鎖可変ドメインを含み、
－前記第２の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、第１の重鎖可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、および第２の重鎖可変ドメインを含み、かつ
－前記第１の軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインおよびＣＬドメインを含み、
前記第１の重鎖可変ドメインおよび前記第２の軽鎖可変ドメインが第１の結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変ドメインおよび前記第１の軽鎖可変ドメインが第２の結合部位を形成する、
請求項１から９のいずれか一項に記載の、多価二重特異性抗体を生産するための方法、またはデオキシリボ核酸、または使用、または組換え哺乳動物細胞、または組成物、または組換え哺乳動物細胞を生産するための方法。
（【請求項１１】以降は省略されています）
発明の詳細な説明【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞株作製およびポリペプチド生産の分野に関する。より正確には、哺乳動物細胞のゲノムへの特定の発現カセット配列の組込みをもたらす二重リコンビナーゼ媒介カセット交換反応によって得られた組換え哺乳動物細胞が、本明細書において報告される。前記細胞は、多価二重特異性抗体を生産するための方法において使用することができる。
続きを表示（約 2,200 文字）【背景技術】
【０００２】
例えば抗体などの、分泌されるグリコシル化されたポリペプチドは、通常、安定発現または一過性発現のいずれかとして真核細胞において組換え発現されることにより生産される。
【０００３】
目的の外因性ポリペプチドを発現する組換え細胞を作製するための１つの戦略は、該目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダムな組込みとそれに続く分泌工程および単離工程を含む。しかし、この手法にはいくつかの不都合な点がある。第一に、細胞のゲノム中へのヌクレオチド配列の機能的組込みはそれ自体、珍しい事象であるだけでなく、ヌクレオチド配列が組み込まれる場所についてのランダム性を考慮に入れると、これらの珍しい事象の結果、遺伝子発現および細胞増殖に様々な表現型が生じる。「位置効果変異」として知られるそのような変異は、少なくとも部分的に、真核細胞ゲノムに存在する複雑な遺伝子調節ネットワーク、ならびに組込みおよび遺伝子発現のための特定のゲノム遺伝子座の利用可能性に起因する。第二に、一般に、ランダム組込み戦略は、細胞のゲノム中に組み込まれるヌクレオチド配列コピーの数をコントロールしない。実際に、遺伝子増幅法は、高生産細胞を実現するために使用されることが多い。しかし、このような遺伝子増幅は、例えば不安定な細胞増殖および／または生産物発現などの望ましくない細胞表現型を招く可能性もある。第三に、ランダム組込みプロセスにつきものの組込み遺伝子座不均一性が原因となって、目的のポリペプチドについて望ましい発現レベルを示している組換え細胞を単離するためにトランスフェクション後に何千個もの細胞をスクリーニングすることには、時間がかかり、大きな労働力を要する。そのような細胞を単離した後でさえ、目的のポリペプチドの安定な発現は保証されておらず、安定な市販用生産細胞を得るには、さらなるスクリーニングが必要とされる場合がある。第四に、ランダム組込みによって得られた細胞から生産されるポリペプチドは、高度の配列差異を示し、これは、高レベルのポリペプチド発現を選択するために使用される選択剤の変異原性にいくらか起因する可能性がある。最後に、生産しようとするポリペプチドの複雑性が高いほど、すなわち、目的のポリペプチドを細胞内で形成するのに必要とされる異なるポリペプチドまたはポリペプチド鎖の数が多いほど、互いに異なるポリペプチドまたはポリペプチド鎖の発現比率をコントロールすることが、より重要になる。発現比率のコントロールは、目的のポリペプチドの効率的な発現、正確な組立て、および高い発現収率での成功裡な分泌を可能にするために必要とされる。
【０００４】
リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）による標的指向性組込みは、真核生物宿主ゲノムのあらかじめ定められた部位に特異的かつ効率的に外来ＤＮＡを導くための方法である（Ｔｕｒａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０７（２０１１）１９３～２２１（非特許文献１））。
【０００５】
国際公開第２００６／００７８５０号（特許文献１）では、抗ＲｈＤ組換えポリクローナル抗体および個々の宿主細胞のゲノム中への部位特異的組込みを用いる製造方法が開示されている。
【０００６】
Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｙ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９（２０１３）１３０７～１３１５（非特許文献２））は、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ技術とＣＲＥ－Ｌｏｘ技術を組み合わせて用いて、標的指向性細胞株開発のために信頼のおける宿主を限定的なゲノムスクリーニングによって迅速に同定したことを報告した。
【０００７】
国際公開第２０１３／００６１４２号（特許文献２）では、そのゲノム中にドナーカセットを安定的に組み入れた、遺伝的に変更された真核細胞のほぼ均質な集団を開示しており、該ドナーカセットは、ターゲティング核酸部位および選択可能マーカータンパク質コード配列を含む単離された核酸断片に作動可能に連結された強力なポリアデニル化部位を含み、該単離された核酸断片は、第１の組換え部位および第２の異なる組換え部位に挟まれている。
【０００８】
国際公開第２０１８／１６２５１７号（特許文献３）では、ｉ）発現カセット配列およびｉｉ）異なる発現ベクター間での発現カセットの分布に応じて、発現収率および生産物の質に大きな差異が認められたことが開示されている。
【０００９】
Ｔａｄａｕｃｈｉ，Ｔ．らは、抗体の発現を困難にするものを体系的に調査するために、調節された標的指向性組込みの細胞株開発アプローチを利用することを開示している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３５（２０１９）Ｎｏ．２，１～１１（非特許文献３））。
【００１０】
国際公開第２０１７／１８４８３１号（特許文献４）では、真核細胞における組換えタンパク質の部位特異的組込みおよび発現を開示しており、特に、発現増強遺伝子座を使用することによる、真核細胞、特にチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ）細胞株における二重特異性抗体を含む抗体の発現を改善する方法を開示している。この文献のデータは匿名化された方法で提示されているため、実際に示されている内容を結論付けることはできない。
（【００１１】以降は省略されています）

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